质粒DNA的提取方法总共有哪些，回答的全给高分？？？

2025-03-25 20:16:21

推荐回答（3个）

回答1：

碱裂解法：
此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下：
1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管
8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中
煮沸法
1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
酚氯仿裂解法
① 从琼脂平板上挑取转化菌阳性克隆，接种到标准LB培养液中（含有卡那霉素30 μg/mL）摇菌12 h；收集1.5 mL菌液，8000 g/min离心3 min，弃上清，沉淀加入200 μL TE，充分混匀；加入400 μL酚氯仿（1∶1体积）混合液，剧烈振动10 s，混匀；12 000 g/min离心5 min，1 mL胰岛素注射针收集上清，尽量避免吸入蛋白沉淀层；上清经国产0.22 μm针式滤器过滤1次；向过滤上清液内加入2倍体积无水乙醇，振荡10 s，12 000 g/min离心5 min；沉淀溶于20 μL的RTE溶液中，37℃水浴. ② 按PstI内切酶说明书进行酶切反应（37℃，1 h）. 酶切产物10 μL，10 g/L琼脂糖凝胶电泳. ③ PCR引物根据参考文献〔1〕设计，预计扩增产物片断大小为714 bp. ④ 常规制备感受态菌E.coli DH5a，提取质粒DNA常规转化感受态，涂于含有卡那霉素（30 μ/mL）LB培养平板中，37℃培养，15 h后观察筛选克隆情况.
碱解法
操作步骤
1、细菌繁殖
LB培养基，2 ml/20ml，37℃，200rpm，摇一摇，过夜
2、离心10 min，5000 rpm, 4℃；弃上淸液
3、沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5000 rpm, 4℃
加入预冷的1 ml Solution I，冰浴，10 min
4、重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min
5、加入1.2 ml Solution II, 冰浴，5 min
6、加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12000 rpm, 4℃
7、加入1.5 ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15 min
8、离心10 min，12000 rpm, 4℃
9、取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中
10、加入40 ul，3 M NaAc
11、酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀
12、离心10 min，12000 rpm, 4℃
13、取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。
14、电泳检测提取DNA的质量
还有碱变性法、SDS法、羟基磷灰石层析法等

回答2：

回答3：

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
仪器、材料与试剂]
（一）仪器
1、恒温培养箱
2、恒温摇床
3、台式离心机
4、高压灭菌锅
（二）材料
1.葡萄糖
2.三羟甲基氨基甲烷（Tris）
3.乙二胺四乙酸（EDTA）
4.氢氧化钠
5.十二烷基硫酸钠（SDS）
6.乙酸钾
7.冰乙酸
8.乙醇
9.盐酸（HCl）
10.Bt菌株
11.吸头、小指管
（三）试剂
1、溶液I
50mmol/L 葡萄糖
5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris•HCl
10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）
2、溶液II
0.4mol/L NaOH , 2% SDS ,用前等体积混合
3、溶液III
5mol/L乙酸钾 60mL
冰乙酸 11.5mL
水 28.5mL
4、 TE缓冲液
10mmol/L Tris•HCl
（一）提取质粒
1、将Bt菌株接种于LB液体培养基中，30℃振荡培养过夜。
2、取1ml培养物倒入Eppendorf管中，12000r/min离心30sec。
3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。
5、加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧管皿，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上。
6、加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。
7、 12000r/min，离心5min，将上清夜转至另一Eppendorf管中。
8、向上清夜加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置5~10min。12000r/min离心5min。倒去上清夜，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
9、用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清夜，真空抽干或空气中干燥。
10、50μL TE缓冲液，使DNA完全溶解，-20℃保存
这下边应该全点

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