考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量的优缺点?

2025-02-11 02:16:57

推荐回答（5个）

回答1：

在酸性条件下，考马斯亮兰g-250染料与蛋白质疏水区结合，导致最大吸收峰由465
nm
变为595
nm，同时颜色也由棕色变为蓝色,该蓝色化合物颜色的深浅与蛋白质浓度的高低成正比关系。将蛋白质样品或稀释的bsa
与bradford试剂混合，测量在595
nm处的吸收值，在建立由一系列稀释的bsa建立的标准曲线的情况下，蛋白质的浓度可以根据标准曲线而确定。
考马斯亮蓝g-250（coomassie
brilliant
blue
g-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝g-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1
000μg/ml，最小可测2.5μg/ml蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
考马斯亮蓝有g250和r250两种。其中考马斯亮蓝g250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝r250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：
该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。如tritonx-100、sds、np-40等。
1．bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝g-250溶于50ml
95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。
2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。
3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用pbs)。
4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。
5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min．
6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。
注意：
考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝g-250
定量结合。当考马斯亮蓝
g-250
与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从
465nm
变为
595nm。在考马斯亮蓝
g-250
过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝
g-250
从吸收峰为
465nm
的形式转变成吸收峰为
595nm
的形式，而且这种转变有一定的数量关系。一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在
595nm
处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝
g-250
显色法来测定溶液中蛋白质的含量。长期以来，人们一直习惯用
lowry
法来测定蛋白质浓度，
但近些年来，
越来越多的人开始用考马斯亮蓝
g-250显色法来测定蛋白质浓度，与
lowry
法相比，该方法具有下列优点：①方法简单，只需一种显色液。②反应迅速，只需一步反应，显色可在
5
min
之内完成。③干扰少，许多被认为对
lorwy
法有干扰的物质（如糖、缓冲液、还原剂和络合剂）不影响该方法。尽管该方法有如此多的优点，但在实际应用中也有其缺点，如线性关系不很好，因此使用该方法测定蛋白质浓度时应特别注意。

回答2：

Bradford法的突出优点是：
（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。
（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

回答3：

优点：染色简单迅速，干扰物质少，灵敏度高。

缺点：
一般风光光度法都有较大的机器误差（重复性较差），为了数据准确需要每次进行标准曲线的测定。
生物测定常用试剂：sds和Triton对该方法有干扰，限制了该法的使用。

回答4：

回答5：

是的

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