如何设计引物，扩增目的基因的ORF
无论您是先提RNA再做反转录,还是直接从DNA中获得基因,考虑到模板的复杂性,都应当使用巢式PCR.建议您先从目的基因的上下游设计一段引物,即外引物,再根据目的基因上下游设计一段内引物.
外引物不在目的基因上,可以在目的基因上下游100bp以内,这就可以利用引物设计软件找出最优秀的引物,提高了第一次PCR的成功率.将第一次PCR产物做模板,进行第二次PCR,这样如果P出了大小正确的条带,就可以肯定是你的目的条带.因为两次特异性扩增再加上大小正确,这样的总特异性是极高的.
另外,由于在第二次PCR过程中,模板是第一次PCR产物,成分单一,就是内引物再糟糕,也没有问题,这就规避了你提到的“那如果在CDS区两端设计不出引物怎么办?”这个问题.
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