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在所 有 的 翻译后修饰中，可逆的磷酸化，几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神
经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。据统计，哺乳动物细胞内有三分之一以上的蛋白质可以被磷酸化川，蛋白质的可逆磷酸化使得蛋白质组学研究更为复杂。 真核 生 物 细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为
丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，其比例大概为1800:200:11 21。大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是可变的。因此，一种蛋白可能有多种磷酸化形式。虽然对磷酸化蛋白质组学分析已有很大进步，但依然存在多个难点19待解决包括磷酸化蛋白和肤段的富集，可逆性磷酸化位点的鉴定以及磷酸化位点的定量等。1 磷酸化蛋白的识别
磷 酸 化 蛋白在细胞中含量甚微。在质谱分析中，磷酸化肚段的信号往往被非磷酸化肤段的信号所抑制。因而磷酸化蛋白和肤段的富集在提高磷酸化 位点的检测中占有非常重要的地位。
1. 1 磷酸化蛋白的富集
过 去 关 于 磷 酸化蛋白富集的方法主要应用针对特 定蛋白的抗体进行免疫沉淀。但该法需要首先对
蛋 白有所了解，且不适合大规模研究。虽然，近来关 于针对磷酸化基团的抗体已经出现，但只有抗磷
酸化酪氨酸的抗体效果较好[41。而抗磷酸化丝氨酸 、苏氨酸的抗体特异性均不强。近来，商品化的
磷 酸化蛋白提纯和富集试剂盒，在酵母中已成功应用，但在其它组织的应用还未见报道川。
1.2 磷酸化蛋白胶染色
检测 蛋 白 混合物中磷酸化蛋白的经典方法是先
行电泳分离蛋白质，然后用放射自显影术或针对磷
酸化蛋白的免疫印记方法来检测。近来，Pro-Q Diaround
磷酸化蛋白胶染色是一项重大的技术突
。破b]。这种特殊的荧光染料可以直接在胶内检测
针对磷酸化丝氨酸、苏氮酸和酪氨酸的蛋白，而不
需特殊的抗体或同位素标记。这种染色适用于
SDS-聚丙烯酸胺凝胶和二维聚丙烯酞胺凝胶，并旦
这种染色和后续的质谱鉴定是完全兼容的。SYPRO
Ruby染色是针对总蛋白的染色。通过每条泳带或
每个点的Pro-Q Diamond染色和SYPRO Ruby染色
的比值，可以了解磷酸化蛋白在总蛋白中的比值。
两种蛋白染色结合使用，可以将高丰度蛋白的低磷
酸化状态与低丰度蛋白的高磷酸化状态区分开
2 磷酸化肤段的富集
磷酸 化 位 点的检测往往不是直接从蛋白水平检
测，而是从肤段水平检测。但由于L述提到的抑制
现象的存在，在分析之前应首先对磷酸化肤段进行
富集。
2.1 固定金属亲和色谱
目前 使 用 最广泛的分离和富集磷酸化肚段的方
法是固定金属亲合色谱(immobilized metal affinity
chromatography, IMAC)。此方法中，键合在鳌合
底物上的金属离子(如Fe3. , Gas. , Cue'等)选
择性地与磷酸化脸中的磷酸基团结合，在高pH值
或磷酸盐缓冲液中磷酸化肤可以释放出来。洗脱下
来的溶液经脱盐处理后可直接用于质谱分析。
IMAC通常可富集到磷酸化的酪氨酸、丝氮酸和苏
氨酸残基。但这种方法的局限性在于:可熊会丢失
掉一些低丰度的没有结合到IMAC柱上的磷酸化肤
段;具有多磷酸化位点的肤由于其较强的亲和力很
难被洗脱下来;某些酸性基团(如天冬氨酸和谷氨
酸)、电子供体文如组氨酸)也会结合到柱上·，造
成非磷酸化肤的污染。所以用IMAC方法富集磷酸
化肤的效果如何，绝大部分依赖于所选择的金属离
子、填充柱的材料、及洗脱的程序。最近，Ficarro
等[C1在IMAC富集以前，将肤的酸性残基进行酷化
处理，使其特异性大大提高，预期对大范围磷酸化
分析具有广阔的前景。
2.2 磷酸化肚段的化学修饰
近来 ， O da等[1-1将肤或蛋白混合物置于碱性硫
代二乙醇溶液中，通过P2消除从磷酸化丝氨酸或
苏氨酸中去掉磷酸基团H3P0 ,，形成的双键受到硫
代二乙醇的作用，琉基取代磷酸根。生物素与琉基
相连，被标记的肤或蛋白质上样于固定有亲和素的
层析柱，通过生物素与亲和素的高亲和力作用而达
到磷酸化肤或蛋白质富集的目的。这一方法的主要
缺点在于它不能富集酪氨酸磷酸化的蛋白质和肤。
Zhou等I〕用另外一种方法修饰磷酸化肮，用碳二
亚胺浓缩反应将半胧氨酸加在磷酸盐部分，修饰过
的肤段以共价键与碘乙酞胺树脂结合，酸洗涤释
放。此方法既可用于富集磷酸化酪氨酸也可用于富
集磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸，但需要许多步化
学反应和柱纯化过程。
蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因。蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸化。蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一,其磷酸化和去磷酸化这一可逆过程,受蛋白激酶和磷酸酶的协同作用控制.酶蛋白的磷酸化是在蛋白激酶的催化下,由ATP提供磷酸基及能量完成的,而去磷酸化则是由磷蛋白磷酸酶催化的水解反应.在哺乳动物细胞生命周期中,大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰;在脊椎动物基因组中,有5％的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸(酯)酶[1].真核细胞的蛋白质磷酸化位点主要发生在丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)残基侧链的羟基上,不同的蛋白激酶可识别和修饰不同蛋白质的不同位点,生物体内能被磷酸化修饰的蛋白质组成磷酸化蛋白质组(phos-phoproteome),磷酸化蛋白质组将是蛋白质翻译后修饰的研究热点. 蛋白质的磷酸化是一种可逆性的蛋白质翻译后修饰，在生物体内起着极为重要的作用. 近年来蛋白质翻译后修饰日益
成为蛋白质组研究的热点之一. 定量磷酸化蛋白质组学方法和技术的快速发展为研究蛋白质磷酸化时空动态变化，更好地了
解生物学功能调节网络奠定了坚实的基础. 作为蛋白质组学研究的一个重要组成部分，定量磷酸化蛋白质组学因其磷酸化蛋
白质所具有的独特特征，在技术和方法研究方面将面临更为严峻的挑战. 综述了磷酸化蛋白质组学定量的一些分析技术和方
法的发展现状、优缺点以及未来的发展趋势
蛋白质磷酸化分析技术
由于细胞内可能有多达上千个蛋白激酶，体内检测某个蛋白激酶活性非常困难，科学家常用体外激酶活性分析法来检测蛋白激酶活性。该方法能十分可靠地鉴定某个蛋白激酶对底物的磷酸化作用，筛查激酶的特异性底物。
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