为什么过氧化氢(H2O2)在240nm的吸光度下不能调零?

2025-02-10 23:01:02

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回答1：

镉离子胁迫下根系活力测定报告南京师范大学中北学院居东亮18052319 倪泽峰18052228实验概要在Cd2+胁迫下，植物体产生大量的活性氧自由基，导致细胞膜脂过氧化，生理代谢紊乱。同时，也引起活性氧清除系统的一些应激性变化，以清除过量自由基，保护植物体各项生理活动的正常进行。如植物体内的SOD、POD、CAT等抗氧化酶能在一定程度上清除活性氧自由基，降低细胞的受伤害程度。活性氧清除系统主要包括酶系统和非酶系统两大类。前者包括超氧化物歧化酶( SOD) 、过氧化物酶( POD) 、过氧化氢酶(CAT) 、抗坏血酸过氧化物酶(APX) 、谷胱甘肽还原酶(GR)等。后者主要指植物体内的一些还原物质,如抗坏血酸(AsA)或维生素C (Vc) 、类胡萝卜素(Car) 、谷胱甘肽(GSH)及维生素等。组成酶系统的各种酶活性和非酶系统中各种还原物质或抗氧化物质含量的高低,可基本反映出植物体内活性氧清除能力或抗氧化能力的强弱。高浓度重金属能引发植物产生胁迫反应(stress response),其中研究较多的是抗氧化防卫反应。当植物与高浓度Cd、Ni 和Zn 等重金属接触时，其体内积累活性氧种类物质(active oxygen species,AOS)，如超氧化物(superoxide)，过氧化物(peroxide)等。除非植物能有效地消除这些AOS,否则会造成膜脂过氧化，酶失活以及DNA破坏，其中膜系统是受重金属伤害的主要位点。如许多植物对高浓度Cd2+的典型反应症状之一是体内积累H2O2, 因为H2O2能自由穿越膜系统，致使细胞内各个区域受损，这预示抗氧化防卫反应可能在植物耐受Cd 等重金属方面起关键作用。对重金属引发的植物抗氧化防卫反应途径下游的抗氧化酶，如超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(catalase,CAT)，抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase)以及非酶的抗氧化物，如胱氨酸、硫醇类(thiols)、谷胱甘肽和抗坏血酸等研究较多。在植物体内，SOD使超氧化物还原为过氧化物，后者被CAT还原为水和氧气。抗氧化酶在植物耐受重金属方面起重要作用的更直接证据是重金属可使某些植物的抗氧化酶活性增强，如木本植物Salix acmophylla 能超富集Cu、Ni 和Pb, 当土壤中Cu、Ni 或Pb 的浓度达到10 000 mg.L-1 时，该植物体内的过氧化物酶活性增强2 倍以上，SOD活性提高3 倍左右。过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在 470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm 处的吸光度变化来测定过氧化物酶活性。重金属离子胁迫导致水生植物组织体内活性氧代谢加强，H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除H2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性，可以用紫外吸收法测定过氧化氢酶活性实验材料菱水生植物的新鲜叶片和根系紫外分光光度计；离心机；研钵；250 ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支；10ml试管3支；恒温水浴；0.2ml/L PH 7.0磷酸缓冲液;10% H2O2实验方法和步骤根系活力的测定（α-萘氨氧化法） 1实验目的：掌握α-萘氨法测定根系活力。观察重金属胁迫对根系活力的影响。 2实验原理：植物根系能氧化α-萘氨，可通过测定溶液中未被氧化的α-萘氨的量定量测定根系活力。3 实验步骤：1.取50ug/mlα-萘氨和磷酸缓冲液各25ml , 于三角瓶混匀，须根系洗净吸干，取0.2g浸入三角瓶，同样取α-萘氨磷酸缓冲液各25 ml于另一三角瓶，不放根系作对照，5min后，两瓶各取2ml,按步骤3作第一次测定。2.两三角瓶置于25c°恒温箱闭光保存60min，各取2ml，按步骤3作第二次测定。3. 取2ml培养液，加10ml水混匀，再顺次加入1ml对氨基苯磺酸与1ml亚硝酸钠，混匀，观察颜色变化，再定容至25ml,室温，于510nm测定OD值。4．作标准曲线：以50ug/mlα萘氨为母液，配制40，30，20，10，5，0 ug/ml溶液各10ml,各取2ml，按3分别反应，测 OD，以OD 值为纵坐标，浓度为横坐标，作坐标曲线，或计算回归方程。5．根据坐标曲线或回归方程计算出相应浓度。过氧化氢物酶活力测定1实验目的：掌握比色法测定过氧化氢物酶活性的原理和步骤2实验原理：在过氧化氢存在下过氧化物酶能使愈木酚氧化，生成茶褐色物质。该物质在470nm处有最大吸收值，可用分光光度计测其oD值变化来测定其活性。3实验步骤：1提取酶液2现配反应混合液：即50ml PH6.0 磷酸缓冲液 + 28ml愈木酚 + 19μlH2O2(30%)3取两只比色杯，一只加3ml 反应液+0.2ml磷酸缓冲液调零。另一只加3ml 反应液+0.2ml 酶溶液立即计时开始测量每隔10s 读数1次直至OD470>=1.0004计算酶活力大小：过氧化物酶活性：（μ/gFw﹒min）=△A470×VT/W×Vs×0.01×t结果分析1．Cd++对根系活力影响的测定：（1）植物根系能氧化α-萘氨，生成红色的α-羟基 -1-萘氨，起该作用的应该是根系中的氧化酶。重金属离子胁迫对氧化酶的活性产生影响，进而对根系中α-萘氨的残留量产生影响。（2）氧化酶的活性随重金属离子浓度的增大而下降，在10ug/ml的重金属胁迫下，其活性又有很大的增加。2．cd++污染对野菱过氧化氢物酶活性影响（1）酶活性在高浓度下出现应急性升高。在没迫害情况下最高，在20μg/ml时活性突然升高。（2）刚开始时活力渐渐下降。其中也有活力变化较小的，活力波动范围较小。由此可以看出：在受害较轻的情况下,生物体内活性氧增多,抗氧化酶的活性也应急性的升高,在一定程度上可减轻自由基对膜的伤害。而在受害重的情况下,超过了防御反应的限度,植物体结构破坏,酶活性降低,植物的这种保护性反应即消失。至于酶变化趋势的差异,可能与植物自身的结构和对Cd2+的敏感度不同有关。实验心得：通过实验让我们知道老师实施启发式和引导式教学方法，辅以课堂实体演示、CAI课件、录像片和幻灯片等教学手段，把演绎法和归纳法结合起来。将知识传授、素质提高与能力培养结合起来。通过和我们互动，使老师和我们融为一体，在课堂上为增强我们创新思维、参与意识和自我获取知识的能力的训练，营造了一种既严肃又活跃，既紧张又协调的教学气氛，调动了我们积极思维和主观能动性，使我们真正成为学习的主人，提高了教学效果。在实验课题中老师鼓励我们每个人积极的参与，让我们充分发挥自己的主观能力，在实验中积极的去思考问题，进而能开发我们的实验思维。在实验中我们积极的思考，不断创新，敢于向困难挑战，但是我们不莽撞，我们也不是漫无目的而是根据老师的指导和实验用书做为引导来进行实验。我相信只要我们积极的去思考我们一定会把实验做好，并且会取得很好的成绩！

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