我做的RT-PCR,提取的是动物细胞,DNA电泳有痕迹却没有条带,可能的原因有哪些啊?

2024-12-13 16:52:59
推荐回答(4个)
回答1:

首先要明确你做的是PCR是已经验证过的引物吗?如果该引物其他实验中可以成功扩增出cDNA的条带,那么可能是cDNA的问题。
比如cDNA降解或者RNA的杂质较多,这两种原因更多一些,如果是cDNA降解那么你扩增成熟的内参引物效果也会不好。如果是RNA杂质很多可能会影响到反转录和后续的PCR扩增,那么你最好重新提取RNA,建议使用RNAprep试剂盒(TIANGEN)可以非常容易的提取高纯度的完整RNA,去除基因组的效果也很好。
一般动物细胞提取RNA很容易,RNA得率会比较高(除非经过处理细胞大量死亡的),cDNA量一般也较多,如果你想判断是否是cDNA量少,可以多做几个循环,条带会变亮。
如果你的引物没有经过验证也有可能是引物设计不合理或者扩增条件不合适,这种情况下你只需要加上成熟扩增的内参基因平行试验即可。内参扩增好,目的条带不好大多数是扩增条件不合适或者引物设计不合适。cDNA模板过多或者过少都会影响PCR扩增,很多同学担心自己的cDNA浓度低,实际上好多时候cDNA浓度过高也会影响PCR扩增。你可以做一组梯度,比如原液,稀释2倍,稀释4倍的试一下。
如果真的是cDNA浓度太低,而且你的基因本身拷贝数也比较少,那么建议你换用高效反转录酶,比如Quant系列反转录酶,这个是目前反转效率最高的(90%以上)。最新一款FastQuant RT Kit(With gDNase)不但可以快速反转而且可以3min去除基因组残留。

回答2:

别告诉我你是RT了直接跑的电泳,那样浓度低而且不富集,是不行滴

回答3:

建议建立内参,其次很可能是模板量过低,增加模板量试试吧。
你的痕迹是指你跑出来的条带淡,还是根本就没有跑出来,那些条与你的mark对到上吗。如果对不上可能就是不是你的条带.

回答4:

可能是模板量过低,增加模板量试试吧