你第一轮PCR的结果是不是就有弥散或者是引物二聚体？如果是这样的话，原因有以下几个方面（排除酶以及其它试剂的问题）：
1，引物设计不好，这种情况下肯定不行，换引物。
2，你的模板有问题，可能是浓度太低或者是杂质过多抑制了酶的活性，解决办法是换好的酶或者缓冲液，或者是（这个更靠谱））设计巢式引物做巢式PCR，如果引物设计的好，基本就ok了；如果还是做不出来，那就有可能是模板降解或者是你这个片段在模板上就是缺失了的。
弥散……怎么个弥散法？
最大的可能性是胶没配好，或者染料加多了（EB不会）
非特异性扩增的话，适当提高退火温度
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