原核生物和真核生物的启动子结构的差异

根据α-鹅膏蕈碱(α-amanitin)对真核生物RNA聚合酶的选择性抑制，以氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）作为报道基因进行体内表达实验，证明T7噬菌体启动子可为真核生物RNA聚合酶所启动。应用建立的竞争性DNA-蛋白质凝胶沪动技术,分别以TATA框,CAAT框,GC框和八核苷酸序列（octamer）为竞争性寡核苷酸分子，发现人工合成的T7启动子可能与TFD起始转录因子结合，形成DNA-核蛋白质结合物。TATA框和八核苷酸序列分别接入T7启动子上游，CAT实验显示八核苷酸序列可以增强RNA聚合酶对T7启动子的转录起始作用。实验结果表明T7启动子可作为RNA聚合酶的顺式作用因子。
1 材料和方法

1.1 材料

质粒pT7CAT为前文〔2〕所构建。各种酶试剂和CAT测试盒购自Promega公司。序列测定试剂盒购自USB公司。α-鹅膏蕈碱(α-amanitin）购自BioLabs公司。BioTeZ公司合成寡聚核苷酸：T7启动子2条正负序列为T71：5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3′；T72序列为5′-CTCCCTATAGTG-GTCGTATTA-3′。TATA框2条正负链分别为TA1：5′-ATAAAA-3′；TA2：5′-TTTATA-3′。CAAT框2条正负链分别为CA1：5′-GCCAATCT-3′；CA2：5′-GATTGGCC-3′ 。GC框2条正负链GC1：5′-GGCGG-3′；GC2：5′-CGCCC-3′。八核苷酸序列2条正负链分别为OC1：5′-TTTGCAT-3′；OC2：5′-TGCAAAT-3′ 。

1.2 方法

1.2.1 常规分子生物学技术 DNA分子的体外重组，大肠杆菌DM52的转化，重组DNA分子的序列测定证实，磷酸钙朌NA沉淀法转化CHOJT细胞和HeLa细胞培养根据文献〔5〕提供的方法进行。

1.2.2 CAT活性检测 CAT实验主要按照文献〔2，6〕方法进行。106的CHO JT细胞抽提物与0.5Ci的14C-氯霉素在37℃下保温1h。点样于TLC硅胶板上，氯仿和甲醇中薄层层析分离产物，放射性自显影鉴定。其中进行α-鹅膏蕈碱敏感实验时,培养的细胞在DNA转染后，分别在不同的时间内在细胞培养液中添加10g／ml的α-鹅膏蕈碱,35h培养后收获细胞，测试CAT活性。

1.2.3 竞争性凝胶泳动实验 HeLa细胞常规培养至总量1010个，根据Andrews方法〔7〕制备核提取物。人工合成的T7启动子2条T71和T72寡聚核苷酸片段用γ-32P-ATP和T4多聚核苷酸激酶进行末

端标记。标记产物经Sephadex G-25柱分离纯化。常规的DNA-蛋白质结合凝胶泳动实验如下:20μl体积的反应液中含有cpm值约为5000的标记寡聚核苷酸，10μg的核抽提物，0.5μg的Poly（dI／dC），10mmol／L Tris-HC1(pH7.9）,10mmol／L MgCl2,50mmol／L KCl, 1mmol／L DTT, 0.5mmol／L EDTA和5%的甘油，室温下放置30min。DNA-蛋白质复合物于5%低离子非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，80℃真空干胶，－70℃放射自显影。进行竞争性的DNA-蛋白质结合凝胶泳动实验时,寡聚核苷酸序列除了T7启动子外，分别加入100倍（克分子数）于T7启动子的寡核苷酸序列作为DNA结合蛋白的特异性竞争性序列，其余步骤按常规的凝胶泳动实验进行。

2 结果

2.1 T7启动子为真核生物RNA聚合酶Ⅱ所识别

真核生物转录系统共有3种RNA聚合酶：RNA聚合酶（PolⅠ）、RNA聚合酶（PolⅡ）和RNA聚合酶（PolⅢ）。这些RNA聚合酶分别识别不同类型的启动子，并对α-鹅膏蕈碱表现出游同的敏感度．α-鹅膏蕈碱不影响Pol Ⅰ的启动转录活性，但对PolⅡ和Pol Ⅲ的转录起抑制作用，不过其抑制浓度不同，当α-鹅膏蕈碱浓度在1μg／ml以上时，将抑制PolⅡ的活性；α-鹅膏蕈碱浓度在100μg／ml以上时，则抑制Pol 的活性，体内和体外实验都表现出同一现象〔8〕。根据这一机制，将含有在T7启动子下游组装有CAT基因的pT7CAT质粒3μg转染CHO JT细胞（1×105），转染后的细胞在5h、20h、30h时分别加入10μg／ml的α-鹅膏蕈碱,各批细胞均培养35h，进行CAT实验（图1）：0h和20h时加入α-鹅膏蕈碱,基本上不能检出CAT活性，30h时加入α-鹅膏蕈碱的转染细胞能检出约20%的CAT活性。10μg／ml的α-鹅膏蕈碱抑制了真核生物转录系统对T7启动子的启动作用。实验显示真核生物RNA Pol Ⅱ负责对T7启动子的转录起始。

图1 α-鹅膏蕈碱对T7启动子控制的报道基因产物CAT活性影响检测

A、B、C：分别为转染细胞收获前30h、15h、和5h时加入α-鹅膏蕈碱的实验；D：转染细胞不加α-鹅膏蕈碱

Fig.1 CAT activity from T7 promoter with α-amanitin in the CHO cells A,B,C:CAT activity from the cells exposed to α-amanitin for the last 30h,15h,5h before cells harvesting,respectively;D:CAT activity fromthe cell in absence of α-amanitin

2.2 T7启动子是TBP蛋白的结合序列

真核生物RNA聚合酶识别的启始子控制mRNA的转录，此类启动子包含有多种顺式作用因子，常见的顺式作用因子有TATA框、CAAT框、GC框和八核苷酸序列。这些序列和相应转录因子结合在转录起始中起作用。T7启动子为RNA聚合酶所识别，启动报道基因的转录。为研究T7启动子与转录因子的作用，利用竞争性凝胶泳动技术（competitive electrophoretic mobility shift assay, CEMSA）来检测T7启动子作为真核生物RNA聚合酶Ⅱ顺式作用因子的功能。实验将已知相应结合蛋白的TATA框、GAAT框、GC框和八核苷酸序列（octamer）作为竞争性分子来测定T7启动子的结合蛋白因子（图2）：在没有竞争性分子存在时，人工合成23bp的T7启动子，可与HeLa细胞核抽提物形成一个复合物（图2，A）；当加入标记的T7启动子和未标记的TATA序列时（克分子数比例为1100）进行竞争实验时，原先的DNA－蛋白质带放射性强度大减弱（图2，B），表明TATA序列与T7启动子竞争结合蛋白质因子，由于未标记的TATA序列数量上远多于标记的T7启动子序列，所以放射性DNA-蛋白制裁带减弱,结果显示T7启动子能与真核生物TATA结合蛋白结合。图2，C、图2，D和图2，E中的竞争性分子分别是CAAT框、GC框和八核苷酸序列，这些实验中的放射性DNA-蛋白质带依然保持,表明T7启动子结合的蛋白与上述3个DNA序列识别的蛋白质因子是不一样的。TATA框、CAAT框、GC框和八核苷酸序列分别为TBP、CTF／NF1、SP1和Oct-1所特异性结合〔9〕，因此竞争性凝胶泳动技术表明T7启动子在真核生物转录系统中是与TBP蛋白质结合的顺式元件。

图2 竞争性凝胶泳动实验放射性自显影图

A：无竞争性分子时的CEMSA实验；B、C、D、E：竞争分子分别为无标记的TATA框、CAAT框、GC框、和八核苷酸的CEMSA实验

Fig.2 Autoradiograms of competitive electrophoretic mobility shift assay

A:CEMSA with end-labelled T7 promoter;B,C,D,E:CEMSA with end-labelled T7 promoter and TATA box,CAAT box,GC box ,and octamer ,respectively

2.3 八核苷酸序列和TATA序列对T7启动子的作用

质粒pT7CAT是将CAT基因接入pGEM质粒T7启动子下游构建而成，利用质粒T7启动子上游第15个碱基的Pvu 酶切位点。将人工合成的TATA序列和八核酸序列分别插入pT7CAT质粒T7启动子上游，构建成pT7TATACAT和pT70CTCAT质粒。测序证实两个调控序列已插入PvuⅡ位点（图3和图4）。将pT7TATACAT和pT70CTCAT质粒各3g转染CHO JT细胞（5×104），转染后的细胞培养30h，进行CAT实验：pT7TATACAT和pT7CAT质粒表达的CAT基因产物活性差别不大（图5，A和图5，B）。但pT70CTCAT质粒表达的CAT活性比pT7CAT表达的活性要强得多（图5，C和图5，D），显示八核苷酸序列能增强T7启动子的RNA聚合酶Ⅱ所启动的功能。在真核生物转录中TATA序列作为定位因子起作用的，而八核苷酸序列能增强真核生物启动子的转录功能。实验结果证明了T7启动子能作为真核生物转录启动元件的功能。

图3 重组进pT7质粒的TATA框序列

Fig.3 TATA box inserted in pT7CAT

图4 重组进pT7质粒的八核苷酸序列

Fig.4 Octamer inserdted in pT7CAT

图5 调控序列对T7启动子启动CAT基因表达的影响

A：T7启动子控制下的CAT活性；B：T7启动子和TATA框控制下的CAT活性；C、D：T7启动子和八核工业苷酸序列控制下的CAT活性

Fig.5 CAT activity from T7 promoter under the sequence elements

A:CAT activity from T7 promoter under the sequence elements control of T7mpromoter,B:CAT activity from teh cells transfected with CAT gene under control of T7 promoter and TATA box;C,D:CAT activity from the cells transfected with CAT gene under control of T7 promoter and octamer

3 讨论

原核和真核细胞的转录系统有着明显的差异，原核生物较为简单，通常细胞内只有1种RNA聚合酶，真核生物细胞内则有3种RNA聚合酶。从整体的转录机制看，Pol Ⅰ和PolⅢ 的转录系统较为简单，更类似于原核生物，但α-鹅膏蕈碱实验显示人微言轻原核系统的T7启动子在真核生物细胞内的作用是依赖于PolⅡ系统。PolⅡ系统是细胞内最为复杂的转录系统，其识别因子多达数十个，T7启动子长仅为23bp，它为何种蛋白质因子所识别，这是人们关心的问题。竞争性DNA－收据结合凝胶泳动实验显示T7启动子结合的反式作用因子与TATA序列结合的因子是一样的。目前已经知道识别TATA序列是TFⅡD 因子，TFⅡD因子是PolⅡ系统基础转录的一个重要反式作用因子，它含有TBP和TAFs两类蛋白质因子，其中TBP是DNA序列识别因子，结合到特异的序列上，从而触发RNA聚合酶转录的起始〔10〕。T7启动子能与TFⅡD结合，显示了该启动子在PolⅡ系统中作为类似TATA序列顺式作用因子的可能性。真核生物TATA序列具有保守性，其碱基以TA碱基对为主，本实验采用的T7启动子共有23bp，它的序列5′端的5个碱基（TAATA）是AT碱基对，可能这一区域是TFⅡD因子的TBP蛋白识别结合序列，其突变鉴定研究正在进行中。

真核生物PolⅡ系统包含有许多顺式作用因子，这些顺式作用因子以“Mix and Match”模式起作用，即不同的顺式作用因子共同或协同起作用。如果T7启动子作为PolⅡ系统的一个顺式作用元件，它将具有与其他顺式作用元件相互作用调控转录起始的功能。本文实验中将八核苷酸序列置于T7启动子上游，增强了转录的起始，表明顺式作用元件八核苷酸序列能与T7启动子作用，即T7启动子确实也是PolⅡ系统的一个顺式作用元件。但当将TATA序列置于T7启动子上游时，并不能增强报道基因的表达活性。从目前实验结果看T7启动子在PolⅡ系统转录中起的作用可能与TATA序列相仿，但加上一个典型的TATA序列也不能增强启动活性，证实了TATA序列与原核生物－10序列功能上的差异，尽管两者都是由TA碱基对组成，但原核生物－10序列与转录的强度有关，而真核生物TATA序列则与转录的定位相关〔4〕。

T7启动子可能作为TATA序列类似功能的特殊的元件被PolⅡ系统识别。但在Pol系统中，TATA序列不象原核生物启动子的－10序列那样是必不可少的，PolⅡ系统最基本和必要的顺式元件是起始子（initiator）， pT7CAT和衍生质粒中T7启动子区域能被Pol系统起始，说明该区域中应具有起始子，或者Pol 系统有目前尚未知的起始机制。从目前研究看，报道基因mRNA5′末端和T7启动子序列分析显示启动子含有一个类似起始子的序列，突变实验也证实该序列的重要性（另文报道），所以23碱基对的T7启动子可能还包含着类似起始子的顺式作用因子，对它们的研究将促进对Pol Ⅱ系统转录起始的了解。

原核生物启动子：
在基因或操纵子的终末往往具有特殊的终止顺序,它可使转录终止和RNA聚合酶从DNA链上脱落。
例如大肠杆菌色氨酸操纵子后尾含有40bp的GC丰富区，其后紧跟AT丰富区，这就是转录终止子的结构。
终止子有强、弱之分，强终止子含有反向重复顺序，可形成茎环结构，其后面为polyT结构，这样的终止子无需终止蛋白参与即可以使转录终止。
而弱终止子尽管也有反向重复序列，但无polyT结构，需要有终止蛋白参与才能使转录终止。

典型转录终止子的特征：茎环结构，富含GC；含4个以上的U。

原核生物启动子序列包括：CAP序列，增强聚合酶的结合和转录的起始序列（-70~-40）；识别区（-35）；解旋区（-10）；转录起始位（+1）

真核生物启动子：
启动子（promoter）：真核基因启动子是在基因转录起始位点（+ 1）及其5’上游近端大约100~200bp以内（或下游100bp）的一组具有独立功能的DNA序列，每个元件长度约为7~20bp，是决定RNA聚合酶转录起始和转录频率的关键元件。
启动子包括：A。核心启动子（core promoter）：是指足以使RNA聚合酶Ⅱ转录正常起始所必需的、最少的DNA序列。其中包括转录起始位点或起始子（initiator）（+1）：一般是A或G及转录起始位点上游-25/-30bp处富含TA的典型元件TATA框。
B。上游启动子元件(upstream promoter element，UPE)：包括通常-70bp附近的CAAT框：GGCCAATCT和GC框：GGGCGG等，能通过TFⅡ-D复合物调节转录起始的频率，提高转录效率。

RNA聚合酶II的启动子:
第一个部位为帽子位点，即转录起始位点。其碱基大多为A（指非模板链），两侧各有若干个嘧啶核苷酸。
第二个部位为TATA框（Hogness box）。它位于-25个bp其共有序列为：TATAA/TAA/T，基本上由AT碱基对所组成，只有很少启动子中有GC碱基对的存在。
第三个部位 为CAAT框。其共有序列为GGC/TCAATCT，一般位于-75（-100～-200）附近。虽然此序列名为CAAT框，但其中头两个G的重要性并不亚于CAAT部分。CAAT框为上游控制元件，为转录所需。
第四个部位是增强子（enhancer），又称远上游序列（far upstream sequence）。一般都在-1OO以上。增强子的作用主要是，对依赖于TATA框的转录和不依赖TATA框的转录都有增强效应，但对前者增强效应高；距离效应和极性效应。