液相色谱仪的使用步骤??

2024-12-08 07:33:35
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回答1:

目的:制定规范的高效液相色谱仪操作、维护保养和清洁规程。
范围:适用于Agilent 1260 HPLC。
责任:色谱检验工程师负责本规程执行。
内容:
1 开机
1.1 打开电脑。
1.2 打开液相色谱各个模块的电源。
1.3 双击桌面“仪器—联机”,进入联机界面。
1.4 排气:
1.4.1 手动旋开泵处冲洗阀(逆时针旋转约1圈)。
1.4.2 右键单击“泵”图标区域,选择“方法…”选项,进入泵编辑画面,设流速:5ml/min(一般为3-5ml/min),点击“确定”。
1.4.3 右键单击“泵” 图标,点击“控制…”选项,选中“ON”,点击“确定”,则系统开始冲洗,直到管线内(由溶剂瓶到泵入口)无气泡为止,(一般为5分钟),切换通道继续冲洗,直到所有要用通道无气泡为止。
1.4.4 右键单击“泵” 图标,点击“方法…”选项,设流速:0ml/min,手动旋紧冲洗阀。
1.4.5 右键单击“泵”图标,点击“方法…”选项,按照方法要求选择合适比例的流动相,设流速:1.0ml/min。
1.4.6 同理右键单击“柱温箱”,“检测器”图标,点击“方法…”选项,按照方法的要求设置温度,波长,点击“控制” 选项,“ON”打开柱温箱和检测器。

2 编辑方法
2.1 点击“方法”-“编辑完整方法”开始编辑完整方法。
2.2 选中除“数据分析 ”外的三项,进入下一选项卡。
2.3 方法信息:在“方法注释”中加入方法的信息(如:This is for test!)。进入下一选项卡。
2.4 泵参数设定:在“流速”处输入流量, 如1.0ml/min,停止时间:如10 min(该停止时间仅为做一个样品需要的时间),按照要求选择合适比例的流动相配比,如乙腈:水=75:25,A为水,B为乙腈,则设置B:75%即可。进入下一选项卡。
2.5 自动进样器参数设定: 选择“洗针进样”----可以输入进样体积和洗瓶位置,进入下一选项卡。
2.6 柱温箱参数设定: 在“温度”下面的空白方框内输入所需温度,如:40度。进入下一选项卡。
2.7 UV检测器参数设定: 在“波长”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm。点击确定。
2.8 在“ 运行时选项表 ”中,选中“ 数据采集”,点击“确定”。
2.9 从“方法”菜单,选中“方法另存为…”,输入一方法名,如“测试”,点击“确定。

3 单次采集
3.1 从“运行控制”菜单中,选择“样品信息”选项,选择合适的路径,在“数据文件”中选择 “前缀/计数器”,输入样品瓶的位置,点击“确定”。
3.2 基线平稳后约10分钟,从“运行控制”菜单中选择“运行方法”。

4 多次数据采集
4.1 按照步骤2 编辑完整方法。
4.2 点击“序列”-“序列表”,输入“样品瓶”“样品名称”,“进样次数”,选择合适的“做样方法”
4.3 点击“序列”-“序列参数”,选择序列数据的保存路径(序列会自动生成以“序列名称-时间”为名称的文件夹保存数据),数据建议以选择 “前缀/计数器”保存。
4.4 从“序列”菜单,选中“序列另存为…”,输入一序列名,如“测试”,点击“确定。
4.5 从“运行控制”菜单中选择“运行序列”。

5 数据分析(脱机状态使用)
5.1 双击“仪器 —脱机”图标 进入的脱机画面。
5.2 从“视图”菜单中,点击“数据分析”进入数据分析画面。
5.3 从“文件”菜单选择“调用信号”,选中您的数据文件名。点击“ 确定”,则数据被调出。(如预建立标准曲线,应先打开浓度较低的标样图谱。)
5.4 做谱图优化:从“图形”菜单中选择“信号选项”。从“范围” 中选择“满量程” 或“自动量程” 及合适的时间范围或选择“自定义量程” 调整。反复进行,直到图的比例合适为止。点击“ 确定”。

6 积分:
6.1 从“积分”菜单中选择“积分事件”选项,选择合适的“斜率灵敏度”,“峰宽”,“最小峰面积”,“最小峰高”。点击 ,自动加载积分参数。
6.2 点击左边“√”图标,将积分参数存入方法并退出“积分事件”。
6.3 如积分结果不理想,则修改相应的积分参数,直到满意为止。

7 标准曲线
7.1 点击“校正”-“校正设置”,输入“含量单位”。
7.2 点击“校正”-“新建校正表”,点击确定。输入“化合物名称”和“含量”,点击“确定”,按照提示删除其他组分。
7.3 至此完成单级校正,如要增加校正级别,应从“文件”菜单选择“调用信号”,选中您的数据文件名(第二个标样),点击“校正”-“添加级别”,点击确定,输入“含量”,依次增加校正级别。

8 打印报告
8.1 从“报告”菜单中选择“设定报告”选项,点击“定量结果”框中“定量”右侧的黑三角,选中“外标法”,其它选项不变,点击“ 确定”。
8.2 从“报告”菜单中选择“打印报告”,则报告结果将打印到屏幕上,如想输出到打印机上,则点击“报告” 底部的“打印”钮。
8.3 点击“文件”-“另存为”-“方法”,把数据分析方法保存,下次分析可直接在“文件”-“调用”-“方法”下,将该方法调出使用。(调用的方法中含有积分方法,标准曲线方法和打印报告方法)

9 关机
9.1 关机前,先关紫外灯,用相应的溶剂(甲醇或乙腈)充分冲洗系统大约30分钟。(色谱柱最终应保存在甲醇或乙腈中)
9.2 退出化学工作站,依提示关泵,及其它窗口,关闭计算机。
9.3 关闭Agilent 1260各模块电源开关。

10 其它注意事项
10.1 当样品运行时,切勿打开自动进样器前遮盖,否则进样过程停止。
10.2 系统发生漏液时,机器会检测到并停止进样,状态指示灯为红色。检查擦干并安置好漏液处,擦干漏液传感器,单击ON按钮,系统重新初始化。
10.3 注意紫外灯使用寿命,切勿来回开关紫外灯。

回答2:

高效液相色谱仪的使用

1.色谱柱它包括空柱和填料。空柱是内壁抛光的不锈钢管,内径为4~5mm,长100~250mm。按气相色谱法中洗涤空柱的方法洗净,用匀浆法填充固定相。将此柱装入仪器的管路中,用柱式机械往复泵输入新鲜脱气的流动相。等基线平直后可用苯、萘、菲的混合试液,用正己烷(含 0.05%甲醇)或甲醇:水(83:17)为流动相测定柱效及分离度塔板数在2~3万/ml以上及分离度在1.5以上者,柱效好。为防止柱污染,常用1个 50mm长,4~5mm内径,装有硅胶(40-50mm)或立柱相同填料的保护柱(预柱)接在主柱之前,以延长色谱柱的寿命。反相键合相柱用毕。必须用水充分流经,以洗去盐类、酸碱等杂质防止柱生锈及填料中杂质的积聚,再用甲醇流经洗涤使色谱柱获得再生。

2.流动相的洗脱方式配好经脱气的流动相放于贮液瓶中,经过有滤过头、内径2mm的聚四氟乙烯管流入高压泵进入色谱柱,最后自检测器流出或收集或作废液回收。用流动相洗脱的方式有恒溶剂脱洗法(isocratic dlution),即自洗脱开始到结束,溶剂的配比恒定。另一类为梯度洗脱法(gradicnt clution),即使溶剂的极性强度在色谱过程中逐渐增加。须按一定程序不断改变流动相的浓度配比,从而使同一个试样中组分性质相差较小的及较大的都能在一次色谱过程中很好分离,而整个色谱过程缩短。必须注意,梯度洗脱法不能用于分子排阻色谱及用电化学检测的反相高效液相色谱法中。

3.检测器适用于血药浓度的检测器有紫外线吸收,荧光发射和电化学三种。紫外检测器应用于对紫外光有吸收的药物,大多数药物分子对紫外光有吸收,故能较普遍采用,检测限有0.1μg左右。紫外检测器有固定波长型、可变波长型及扫描器,既能使流动相停流作组分的定性定量检测,又能提高测定灵敏度,重现性较好。荧光发射检测器对能产生荧光的药物才能使用。80年代应用激光替代氙灯光源,光强度增加了3~4倍,对某些药物的检测限可达pg级。电化学检测器是由一个碳糊或破碳做成的蒲层电解池。常用于检测儿茶酚胺类及有酚类基团的各种药物和代谢物。流出组分进入2μl的薄层电解池,在一暄电压下电解产生电流,放大后检测,检测限pg级。

4.数据处理现代高效液相色谱仪带有数据处理系统,除记录谱外,还能自动记录峰的保留时间,能自动积分求算峰面积,并能按照预定的程序作有关计算,报告分析结果。

高效液相色谱仪使用过程中常见问题及其解决方法

1 液相色谱仪系统

液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱、柱温箱、检测器、数据处理系统组成(如图1所示)。对于整个系统而言,柱子、泵和检测器是核心部件,同时也是容易出事故的主要场所。

2 常见问题及解决方法

2.1 针对柱压问题(表1)

柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方,柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值,而是指压力波动范围在50PSI之间。压力过高、过低及波动较大都属于柱压问题,但柱压的高低与色谱柱的种类、品牌、液相系统本身及使用的流动相种类相联系。值得注意的是在使用梯度洗脱时,进柱压的平稳缓慢的变化是允许的。

在实际应用中柱压过高可从以下几个方面来考虑[1]。首先考虑柱子是否被堵,此时可更换一根新柱子进行检测。

2.2 针对保留时间漂移的问题 [2,3] (表2)

保留时间的改变是很多液相色谱使用者常碰到的问题,其包括了保留时间增大和减小。它的产生与很多原因有关。

2.3 针对异常色谱峰问题[2-4]

异常的色谱峰指的是色谱图中无峰或出现负峰、宽峰、双峰、肩峰、峰形不对称等情况。具体情况与原因分析如表3。

3 高效液相色谱仪的保养[5-7]

3.1 HPLC的日常操作条件

工作温度10~30℃; 相对湿度<80%; 最好是恒温、恒湿,远离高电干扰、高振动设备。

3.2 泵的保养

使用流动相尽量要清洁;进液处的沙芯过滤头要经常清洗;流动相交换时要防止沉淀;避免泵内堵塞或有气泡。

3.3 进样器的保养

每次分析结束后,要反复冲洗进样口,防止样品的交叉污染。

3.4 柱的保养

柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动;当柱子和色谱仪连接时,阀件或管路一定要清洗干净;要注意流动相的脱气; 避免使用高粘度的溶剂作为流动相;进样样品要提纯;严格控制进样量;每天分析工作结束后,要清洗进样阀中残留的样品;每天分析测定结束后,都要用适当的溶剂来清洗柱;若分析柱长期不使用,应用适当有机溶剂保存并封闭。

3.5 检测器(UV)的保养

紫外灯的保养要在分析前、柱平衡得差不多时,打开检测器;在分析完成后,马上关闭检测器。同时样品池要保养。

4 结语

在高效液相色谱使用过程中故障排出时要遵守以下原则:一次只改变一个因素,从而确定假定因素与问题之间的联系;如果通过更换组件来排查故障时要注意将拆下的完好组件装回原位,从而避免浪费;养成良好的记录习惯,一个良好的记录是成功地进行故障排除的关键。

总之,在使用高效液相色谱时一定要注意样品的前处理与仪器的正确操作和保养,仪器系统的干净是用好仪器和维护维修仪器的关键。

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回答3:

1、检查溶剂托盘托盘上的溶剂是否足量,以溶剂液面超过过输液管过滤头5厘米以上为宜。
2、检查输液管内部有否气泡,若有,应及时通过排液阀排出。
3、对溶剂(针对第1项看是否需要补充溶剂)和样品进行处理,过滤,脱气。
4、打开主机电源,依次打开检测器,泵A,泵B,柱箱的电源。
5、打开电脑,开启色谱工作站。
6、先在工作站中开启活塞泵,以所需的流动相平衡系统(约需30min)。
7、打开氘灯,等待系统基线走稳。
8、开始进样检测。

回答4:

1,流动相的过滤脱气;
2,系统排气,预热;
3,走基线
4,建立方法,
5,分析样品
6,分析处理数据

回答5:

开机顺序: 

1.检查溶剂托盘托盘上的溶剂是否足量,以溶剂液面超过过输液管过滤头5厘米以上为宜。 

2.检查输液管内部有否气泡,若有,应及时通过排液阀排出。 

3.对溶剂(针对第1项看是否需要补充溶剂)和样品进行处理,过滤,脱气。

4.打开主机电源,依次打开检测器,泵A,泵B,柱箱的电源

5.打开电脑,开启色谱工作站 

6.先在工作站中开启活塞泵,以所需的流动相平衡系统(约需30min)

7.打开氘灯,等待系统基线走稳 

8.开始进样检测


常见故障:

开机后压力在一段时间逐渐变化(升高或降低),这往往是流动相在色谱柱内还没有平衡好、柱箱温度还没有恒定。这些都不属于仪器问题,只要多平衡一会就会稳定。若使用的是梯度程序,由于流动相的比例正处在变化中,压力也会跟随变化。

开机后压力瞬间变化(>3MPa)。原因不外乎以下四种情况:⑴有气泡;(2)漏液;(3)单向阀不良;(4)泵工作相位不正确,可逐个排除。

答案来自

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