RT-PCR 结果，请教问题可能出在哪一部分。谢谢

2024-12-17 09:22:53

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回答1：

你提取的四个RNA中，除了2号浓度很低之外，另外三个肯定符合做RT-PCR的要求了，CDNA也是，浓度是够的。
而电泳图中PCR产物的1234都是引物二聚体，没有出现你的目的基因
所以我的判断是：问题出在PCR这一过程。有可能是引物设计有问题，也有可能是退火温度不合适，或者PCR时间不合适。鉴于你的扩增片段长度都在500以下，
我建议的程序：
94度3分钟，一个循环；
94度20秒，退火（几度就看你引物的Tm值减去3～5度）30秒，72度延伸30秒，循环35次；
72度延伸5分钟。

另外，我想问一下，你的GAPDH这对引物是第一次做还是之前一直在做？因为GAPDH做不出来的话实验体系肯定是有问题的。
如果之前实验室有在用的话，现在做不出来就是试剂的原因了；如果GAPDH引物是第一次做的话，先去验证引物是否真确，另外就是优化PCR扩增条件和试剂组分了。