转化大肠杆菌后,检测为什么用通用引物,不用自己本身的目的片段引物

2025-01-29 14:09:07
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回答1:

根据我的理解,这个问题重点不是到底该用哪对引物,我不认为通用引物优于片段引物,只是在某些特定情况下,才会必须对两者进行严格的区分。

但是针对你提出的问题,也可以将使用通用引物的意义归纳如下:
(1)使用通用引物可以进一步证明平板上生长的转化菌含有目的质粒,而不是污染了其他菌,也可以从某种程度上证明我们转化的质粒没有被污染。而使用目的片段引物虽然能检测到目的片段,但不能证明检测到的目的片段连在相应的质粒上面。
(2)使用通用引物的另一个好处可以检测缺少目的片段引物的片段,毕竟有时候我们构建质粒时插入的外源基因不一定需要通过PCR扩增获得,可能只需要通过合适的酶从另一个含有该片段的质粒上切下来再连到目的质粒上就可以了,这种情况下,不一定备有相应的目的片段引物。如果还需要进行PCR检测,就需要使用通用引物了。
(3)通用引物都是经验证后非常适用于PCR和测序的引物,相对于目的片段引物,PCR得到非特异扩增的概率更低。

但是对较熟练的技术人员来讲,实际操作中用哪一对引物的效果都差不多,除非有某些特殊要求,比如就像第(1)点提到的,我希望能更直接地判断目的质粒的存在。

题外话:其实较理想的PCR检测转化菌的方式是一端使用通用引物,另一端使用目的片段引物,这样得到的PCR结果可信度非常高。即能证明质粒的存在,又能证明片段的存在,同时还证明了片段在质粒中是以我们希望的位置和方向插入的。当然这个引物组合的PCR检测方法不太适用于重组T载体和单酶切连接后得到的重组质粒,因为这样的连接得到的重组质粒中目的片段有两种方向,除非是一定需要目的片段以某个方向插入(这种情况则必须使用通用引物和目的片段引物组合的方式),否则在不知道目的片段方向的情况下,根本不知道该怎样组合通用引物和片段引物。

回答2:

你是想问负责合成rna引物的是什么吧?催化rna引物合成的rna聚合酶叫dna引发酶,大肠杆菌的引发酶由dnag基因编码,长度约11nt。