聚合酶链反应的原理

PCR是体外酶促合成特异DNA片段的新方法，主要由高温变性、 低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链（因其反应过程有高温，所以反应所用的聚合酶必须为热稳定DNA聚合酶）。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。
DNA是由四种碱基按互补配对原则（即腺嘌呤A对胸腺嘧啶T，鸟嘌呤G对胞嘧啶C）组成的螺旋双链。在细胞内，DNA复制时，解螺旋酶首先解开双链让它变成单链做为模板，然后，另一种酶－－RNA聚合酶合成一小段引物（primer）结合到DNA模板上，最后，DNA合成酶以这段引物为起点，合成与DNA模板配对的新链。PCR即是在体外模拟DNA复制的过程，它用加热的办法让所研究的DNA片段变性变成两条单链，人工合成两个引物让它们结合到DNA模板的两端，DNA聚合酶即可以大量复制该模板。
假设扩增效率为“X”，循环数为“n”，则二者与扩增倍数“y”的关系式可表示为：y=(1 X)n。扩增30个循环即n=30时，若X=100%，则y=230=1073741824(>109)；而若X=80%时，则y=1.830=45517159.6(>107)。由此可见，其扩增的倍数是巨大的，将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外灶照射下（254nm）一般都可见到DNA的特异扩增区带。