ELISA操作真的很简单吗

2025-02-10 21:32:49

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回答1：

酶联免疫吸附试验(enayme liked immunosorbent assay，ELISA)是20世纪70年代发展起来的一种检测技术，因其具有敏感性高、特异性强、操作简单等优点，被广泛应用于各种抗原和抗体的测定，为辅助临床诊断与生物科研起到了积极的推动作用。但ELISA测定中影响因素较多，操作过程中每个环节都会对试验结果产生影响，出现错误的结果。现笔者对影响实验结果的常见因素及相应的控制方法分析探讨如下：

1试剂的因素

1.1试剂的选择

试剂的选择是保证血液检测质量的关键要素。虽然国家采用批批检定的形式对ELISA试剂严格把关，但不同厂家的试剂在使用效果上仍存在在差异。要选购知名度相对高、具有“三证”的试剂，不要用无批号的试剂，最好选用与仪器配套的试剂。更不要使用过期的试剂和混用不同批号的试剂。

1.2试剂的准备

在临床实验室，对试剂的准备一般不太注意，通常的做法是在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此，在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20-30 min后，再进行测定，使试剂盒在使用前与室温平衡，这样做的目的能使反应微孔内的温度较快地达到所需的温度，以满足后面的测定需求。

2样本的因素

2.1内源性干扰因素

包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异免疫球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体等。

2.1.1类风湿因子在类风湿患者及正常人血清中，常含有较高或不同浓度的类风湿因子(RF)，其一般为IgM型，亦有IgG和IgA型，具有与变性IgG产生非特异结合的特点，因为在ELISA测定中，其可与固相上包被的特异抗体IgG以及随后加入的酶标的特异抗体IgG结合，从而出现假阳性结果。避免其发生的方法有：①用F(ab)2替代完整的IgG。②标本用联有热变性IgG的固相吸附剂处理。③检测抗原时，可用2-巯基乙醇加入到标本稀释液中使RF降解。

2.1.2补体在固相酶免疫测定中，来自哺乳动物的固相抗体和酶标二抗均有激活人补体系统的功能。一方面，固相抗体和酶标二抗可因其吸附及结合过程中抗体分子发生变构，使Fc段的补体C1q结合点暴露出来，使C1q成为一个中介物将二者交联起来出现假阳性结果。另一方面，固相抗体也会因为活化补体的结合，封闭抗体和抗原的表位结合能力而引起假阴性。解决的办法是：①用EDTA稀释标本。②56℃ 30 min加热血清使C1q灭活。

2.2外源性干扰因素

包括标本溶血、标本被细菌污染、标本保存时间过长和标本凝固不全等。

2.2.1标本的溶血血红蛋白中含铁血红素有类过氧化物酶的活性，因此，在以辣根过氧化物酶(HRP)为标志的ELISA测定中，如血清样本中血红蛋白浓度较高，则很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。所以在采血时应注意手法，采集的血液勿用力振荡，严防标本溶血。

2.2.2标本的污染菌体可能含有内源性辣根过氧化物酶，可使实验出现非特异性显色。因此，ELISA检测宜采集新鲜标本，如不能当时测定，5 d之内应4℃保存，1周后检测应低温冻存；同时，收集标本采用无菌试管，可防止标本的污染。

2.2.3标本的保存标本在冰箱中保存过久，血清中IgG可聚合成多聚体，AFP可形成二聚体，在用间接法测定中会导致本底过深，甚至造成假阳性。冰冻保存的标本反复冻融产生机械剪切力对标本中的蛋白等分子有破坏作用，可引起假阴性结果。因此，ELISA检测尽量采用新鲜标本，长时冻存的样本避免反复融冻[3]。

2.2.4标本凝固不全凝固不全的血清中含有部分纤维蛋白原，可使结果呈假阳性。解决的方法有：①于采血管中加入适当的抗凝剂；②将采集后的血液放在架子上再放入37℃水浴中1 h，待充分凝固后再离心分离血清[4]。

3操作中的因素

3.1加样孵育前加样时间过长，酶试剂加出孔外，使用滴瓶滴加试剂时，滴加的角度不同和挤压的力度不同，致使滴加的试剂量不准，都可导致试验结果不准确。控制方法：①实验样本过多时，可分批次操作，以减少实验时间延长造成的误差；②加酶试剂后，用吸水纸吸干孔外试剂；③作定量试验时，使用加样器加注试剂，并经常校正其准确性，此外，要做到一份样本一个移液头，防止交叉污染。

3.2温育温育是ELISA测定最为关键、最容易出现问题的步骤。最为常见的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2-8℃。目前国内售ELISA试剂盒温育时间为37℃，30 min-1 h，进口ELISA试剂盒则通常为37℃，1-2 h能有较完全的结合。

3.2.1温育时间、温度的选择一般根据试剂盒的说明书选择温育的时间、温度。加完样本和（或）试剂后将微孔板从室温放入水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37℃需要一定时间，如果是将微孔板一放入温箱即开始计时，这样就容易造成实际测定中温育时间不够，易致弱阳性标本测不出来。控制方法：①如有两种温度，尽量使用较低的温育温度、较长反应时间的条件；②用1个小温度计放置在板孔反应液中测量观察。

3.2.2 “边缘效应”的排除“边缘效应”是在使用96孔板的ELISA测定中，外周孔显色较中心孔深的现象。产生的原因可能是为96孔板周围孔与中心孔在温育中的热力学梯度造成的，因此在温育时尽量采用水浴。

3.3洗板　ELISA测定的洗板一般有两种方式，即手工和洗板机洗板。采用手工洗板，孔与孔之间液体易交叉，采用半自动洗板机时，洗液量不足导致洗板不彻底，洗板针堵塞导致抽吸不完全，洗板不畅导致清洗效果差。控制方法：①手工洗板时，拍板时要垂直，避免交叉污染，用力不能过猛，防止抗原抗体复合物脱离；②洗板机洗板时应经常检查冲洗头是否通畅，若被杂物堵塞时可用注射器针头挑出；③为了洗涤效果好，实验室可采用机器与人工洗涤相结合的方法，在机器洗涤后再进行人工洗板1-2次，或适当增加洗板的次数，有资料报道洗板7次能达到理想的洗涤效果[5]。

3.4显色　市售ELISA试剂盒中，如以四甲基联苯胺(TMB)为底物，则提供的底物为A和B两瓶应用液；如以邻苯二胺(OPD)为底物，则试剂盒提供邻苯二胺片剂或粉剂。显色反应条件为37℃或室温反应15-30 min。以邻苯二胺(OPD)为底物的试剂，要临用前30 min配制且必须避光。以四甲基联苯胺(TMB)为底物的试剂则不需避光，但A、B液应尽量避免接触金属器械。

3.5结果判定

读取结果要在15-30 min内完成，定性测定用肉眼判读试验结果时，反应板应水平距离白色背景10-15 cm；定量测定时用酶标仪读取结果，酶标仪不应置于阳光或强光照射下，需先预热15-30 min再进行测试。

综上所述，尽管ELISA法操作简单，但可能影响测定结果的因素也较多。故在实际操作的过程中，要加强质量管理，认真避免或减少影响因素，力求结果准确，为疾病的诊断和科研提供可靠的依据。

回答2：

操作步骤:
1. 包被过程(注意设置空白对照,阴性对照):
将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度(一般所需抗原包被量为每孔20-200μg),每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;弃去孔中液体.(为避免蒸发,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)
2. 封闭酶标反应孔:
5%小牛血清置37℃封闭40min.封闭时将封闭液加满各反应孔,并去除各孔中的气泡,封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍,每遍3min.
洗涤方法:吸干孔内反应液,将洗涤液注满板孔,放置2min略作摇动,吸干孔内液,倾去液体后在吸水纸上拍干
洗涤次数3次
3. 加入待检测样品(建立合适的浓度梯度):
检测时一般采用1:50-1:400的稀释度, 应采用较大稀释体积进行,一般保证样品吸取量>20μl.
将稀释好的样品加入酶标反应孔中,每样品至少加双孔, 每孔100μl,置于37℃,40-60min.用洗涤液满孔洗涤3遍,每遍3min.
4. 加入酶标抗体:
酶标抗体: 根据酶结合物提供商提供的参考工作稀释度进行. 37℃,30-60min之间.短于30min往往结果不稳定.每孔加100μl.洗涤同前。
5. 加入底物液(现用现配):
首选TMB-过氧化氢尿素溶液,OPD-过氧化氢底物液系统次之.
底物加入量:每孔100μl,置37℃避光放置3-5分钟,加入终止液显色.
6. 终止反应:
每孔加入终止液50μl终止反应,于20min内测定实验结果.
7. 结果判断:
OPD显色后采用492nm波长,TMB反应产物检测需要450nm波长.检测时一定要首先进行空白孔系统调零.用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示,当P/N大于2时作为抗体的效价.(数值的大小依具体检测要求而定.)

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