药物敏感试验的药物敏感试验的方法

测定细菌对抗菌药物敏感性的试验称为药物敏感试验或简称药敏试验。由于养鸡业中抗菌药物的广泛使用，导致抗药菌株越来越多，盲目用药常常效果不佳。因此，进行药物敏感试验已成为正确使用抗菌药物的必要手段。药物敏感试验的方法有多种，如纸片扩散法、试管法、挖洞法等。其中，纸片扩散法简便易行，出结果快，是目前生产中最常见的方法，现将该种方法介绍如下：

（1）药敏纸片的准备

常用抗菌药敏纸片已有商品供应，一般可以买到，可直接利用。

（2）药敏培养基的制备

①普通肉汤琼脂：又称营养琼脂。蛋白胨10克、氯化钠（NaCl）15克、磷酸氢二钾（K₂HPO₄）1克、琼脂20克、牛肉浸出液1000毫升（可用牛肉浸膏10克浸于1000毫升蒸馏水代替）。

牛肉浸出液的配制方法：取瘦牛肉去掉脂肪、腱膜等，绞碎或切碎，按500克牛肉加1000毫升蒸馏水混合，置4℃冰箱内过夜，取出后加热到80～90℃，经1小时后，以数层纱布滤除肉渣并挤出肉水，再用脱脂棉过滤，量其体积并用蒸馏水补足1000毫升，分装后20分钟高压蒸汽灭菌，即制成牛肉浸出液。

将以上其他成分加入到牛肉浸出液中，加热溶解，冷却后调pH至7.6，煮沸10分钟，用滤纸过滤后分装，再以10.4万帕高压蒸汽灭菌25分钟，取出后冷却至55℃左右，在90毫升直径灭菌的平皿上倾注成4毫米厚的平板。做好的平板，密封包装后可在冰箱中保存2～3周。使用前应将平皿置37℃温箱中培养24小时，确认无菌后再用于试验。

②鲜血琼脂：将灭菌的营养琼脂加热融化，至45～50℃时加入无菌鲜血5%（每100毫升营养琼脂中加入鲜血5～6毫升）倾注平皿。无菌鲜血，用无菌手术取健康动物（绵羊或家兔等）的血液，加入盛有无菌5%柠檬酸钠溶液的容器中（血与5%柠檬酸钠的比例为9∶1）混匀，置冰箱中保存备用。

（3）试验方法

临床上分离到的细菌进行纯培养。用灭菌的接种环挑取被检菌的纯培养物划线或涂布于平板上，并尽可能使其密而均匀。用灭菌镊子将药敏纸片平放于平板上并轻压使其紧贴平板。直径9.0厘米的平皿可贴7张纸片，纸片间距不少于24毫米，纸片与平皿边缘距离不少于15毫米。贴好后将平板底部朝上置于37℃温箱中培养24小时，取出观察结果。

（4）结果判定

凡对被检菌有抑制力的抗菌药物，由于向周围扩散，抑制细菌的生长，故在纸片周围出现一个无细菌生长的圆圈，称为抑菌圈。抑菌圈越大，说明该菌对此种药物敏感度越高，反之越低。如果无抑菌圈，则说明该菌对此种药物具有耐药性。所以，判定结果时，以抑菌圈直径的大小来作为细菌对该药物敏感度高低的标准。

一般来说，抑菌圈直径70毫米以上为极度敏感，15～20毫米为高度敏感，10～15毫米为中度敏感，10毫米以下为低敏感，无抑菌圈为不敏感。对多黏菌素的作用，抑菌圈在10毫米以上者为高度敏感，6～9毫米为低度敏感。

经药敏试验后，应该选择极度敏感或高度敏感的药物进行治疗。

目前常用的药敏试验方法有：纸片琼脂扩散法（K-B法）、稀释法、E试验、检测细菌耐药性的方法。稀释法分液体稀释法和琼脂稀释法。检测细菌耐药性的方法包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的检测、耐万古霉素肠球菌（VER）的检测、耐青霉素肺炎链球菌（PRP）的检测、超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的检测和β-内酰胺酶的检测。