转染mirna inhibitor需要用rt-pcr检测吗

2025-02-22 06:19:54

推荐回答（3个）

回答1：

理论上是可以用qPCR进行检测的。但是有一种情况可能检测不到抑制效率。即miRNA inhibitor是与miRNA发生结合从而抑制了miRNA发挥作用，但它并没有彻底降解miRNA。这种情况，需要结合靶基因mRNA的表达情况，或者通过检测靶基因的蛋白表达水平来判断inhibitor是否发挥作用。

回答2：

给你推荐pharminova公司的一种转染试剂Ifect RNA：
下面的步骤以24孔板转染 siRNA到哺乳动物细胞为例
贴壁细胞：转染前一天，接种 80,000 个细胞到每孔含 500μL不含抗生素的培养基
的细胞培养板中，到转染时细胞融合度大致为 70－95％。
准备转染复合物：
转染的每孔体积和量
1. siRNA准备：在 microfuge tube中添加5%葡萄糖溶液稀释 0.25?g
（~19pmol）siRNA至12.5μL。
2. ifectRNA试剂准备：在另一个 microfugetube中，加入 1 ?L的 ifectRNA试
剂，添加11.5 μL 5%葡萄糖溶液至总体积 12.5μL。
3. 配置转染复合物：将稀释的siRNA溶液加入配好的 ifectRNA试剂溶液中
（总体积＝25μL）。混合均匀，在室温孵育 10分钟。
添加转染复合物至每孔：
4. 添加 25μL的转染复合物到含有细胞和培养基的培养板每孔中。
5. 将添加转染复合物的培养板放入 37℃二氧化碳培养箱中孵化 24－48小时。
6. 24-48小时后，检测基因转染效果。
问题处理:
1. 提高各种不同的细胞系的转染效率，可以通过提高或降低每孔转染复合物加
入量。在改变质粒DNA浓度时候，请保持 DNA量和ifectDNA体积比例
（e.g. 1 μg DNA : 4 μL ifectDNA）

回答3：

这是用RFECT转染MDCK的方法，本说明书适用于24孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。
A. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔 500 μl 培养基（不可加抗生素），使细胞在转染时密度在30-50% 。
B. siRNA-RFect混合物准备：
1. 6pmol siRNA 用50μl无血清培养基稀释。
2. 2μl RFect用50μl无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育5min。注意：确保在25 min内执行第三步操作，不要过于延迟。
3. 孵育5min后，将siRNA 稀释液与RFect 稀释液混合（总体积100μl）。轻轻混匀，室温孵育20 min。
C. 将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）：
1. 将100μl混合物加入培养孔内，培养孔内含有0.5ml培养的细胞。轻轻晃动培养板，混匀。
2. 37°C培养18-72h，检测基因抑制效果。如果需要，细胞培养4-6h时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、
所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。

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