用紫外分光光度法测定核酸有什么缺点

核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（－C＝C一C＝C 一）,能够强烈吸收250~280nm 波长的紫外光.核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm 处.遵照Lambert-Beer 定律,可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量.
在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同,紫外吸收光也随之表现出明显的差异,它们的摩尔消光系数也随之不同.所以,在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行.
核酸的摩尔消光系数（或吸收系数）,通常以ε（ρ）来表示,即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm 波长处的消光值（即光密度,或称为光吸收）.核酸的摩尔消光系数不是一个常数,而是依赖于材料的前处理、溶液的pH 和离子强度发生变化.它们的经典数值（pH = 7.0）如下：
DNA 的ε（ρ）= 6 000 8 000
RNA 的ε（ρ）= 7 000 10 000
小牛胸腺DNA 钠盐溶液（pH = 7.0）的ε（ρ）= 6 600,DNA 的含磷量为9.2%,含1μg/mL DNA 钠盐的溶液光密度为0.020.RNA 溶液（pH = 7.0）的ε（ρ）= 7 700~7 800,RNA 的含磷量为9.5%,含1μg /mL RNA 溶液的光密度为0.022~0.024.采用紫外分光光度法测定核酸含量时,通常规定：在260nm 波长下,浓度为1μg/mL 的 DNA 溶液其光密度为0.020,而浓度为1μg/mL 的RNA 溶液其光密度为0.024.因此,测定未知浓度的DNA （RNA）溶液的光密度OD260nm,即可计算测出其中核酸的含量.该法简单、快速、灵敏度高,如核酸3μg／mL 的含量即可测出.对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品,测定误差较小,若样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质,测定误差较大,应设法事先除去.
由于降解或水解作用,核酸的光密度可以增高约40％,这就是众所周知的增色效应（hyperchromic effect）.在大分子的核酸中,氢键和π-键相互作用改变了碱基的共振行为.因此,核酸的光密度低于构成它的核苷酸的光密度,该现象称为减色效应（hypochromic effect）.