人血提取基因组1.基本原理是什么？2.步骤及试剂是什么

2025-02-11 16:06:50

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回答1：

血中DNA的提取血液中DNA提取的原理：如果以外周血为DNA提取材料,在外周血中提取DNA就是从有核的白细胞中提取DNA.因此,从外周血中提取DNA包括以下几个关键步骤：第一,破坏红细胞,通常利用红细胞与白细胞膜结构的差异,先使红细胞裂解,经离心后收集白细胞；第二,白细胞裂使膜蛋白和核蛋白变性,游离DNA,通常是采用离子型表面活性剂使蛋白质变性；第三,除去变性蛋白质：通常采用蛋白沉淀剂沉淀变性蛋白质,使DNA留在上清液中；第四,在高盐环境下使DNA从有机溶剂如无水乙醇中析出. 取材取外周血5ml,EDTA抗凝 1.新鲜抗凝血,离心弃去上清液； 2.取出4℃冰箱预冷的ELS裂解液,按1:6-10的比例向细胞沉淀中加入ELS裂解液（1ml细胞压积加入6-10ml裂解液）,轻轻吹打混匀；红细胞裂解液ELS配方： NH4Cl:4.15克加双蒸水500ml,取450ml; Tris:1.0297克加双蒸水50ml,再加上上面的450ml,共计500ml,高压灭菌, 用时加10-20ml 3.800-1000rpm离心5-8分钟,离心弃去上层红色清液； 4.收集沉淀部分,加入Hank’s液或无血清培养液离心洗2-3次； 5.如裂解不完全可重复步骤2和3； 6.重悬细胞,用于后续实验；提取DNA,最好是于步骤4开始使用DEPC水配制的溶液进行. 酚氯仿方法提取DNA 在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础.是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提而实现的.这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析,还可用于PCR的模板、文库构建等实验. 原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏. 一、试剂准备 1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0). 2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl. 3．裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml. 4．20% SDS 5．2mg/ml蛋白酶K 6．Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿 7．无水乙醇、75%乙醇二、操作步骤（一）材料处理 1．白细胞处理 ⑴ 取红细胞裂解完全后收集的沉淀,加入0.5ml TE ⑵ 将匀浆液转移到1.5ml离心管中. ⑶ 加20% SDS 25 μl,蛋白酶K (2mg/ml) 25 μl,混匀. ⑷ 60°C水浴1-3hr. 2．培养细胞处理： ⑴ 将培养细胞悬浮后,用TBS洗涤一次. ⑵ 离心4000g×5min,去除上清液. ⑶ 加10倍体积的裂解缓冲液. ⑷ 50-55°C水浴1-2hr. （二）DNA提取 1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中,温和、充分混匀3min. 2. 离心5000g×10min,取上层水相到另一1.5ml离心管中. 3. 加等体积饱和酚,混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中. 4. 加等体积酚/氯仿,轻轻混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中.如水相仍不澄清,可重复此步骤数次. 5. 加等体积氯仿,轻轻混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中. 6. 加1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇,轻轻倒置混匀. 7. 待絮状物出现后,离心5000g×5min,弃上清液. 8. 沉淀用75%乙醇洗涤,离心5000g×3min ,弃上清液. 9. 室温下挥发乙醇,待沉淀将近透明后加50-100ml TE溶解过夜. (三）DNA定量和电泳检测 1.DNA定量： DNA在260nm处有最大的吸收峰,蛋白质在280nm处有最大的吸收峰,盐和小分子则集中在230nm处.因此,可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度,OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA.如用1cm光径,用 H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照,根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000. DNA纯品的OD260/OD280为1.8,故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度.若比值较高说明含有RNA,比值较低说明有残余蛋白质存在.OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间,若比值较高说明有残余的盐存在. 2.电泳检测：取1μg基因组DNA用行0.8%琼脂糖凝胶上电泳,检测DNA的完整性,或多个样品的浓度是否相同.电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带. 三、注意事项 1. 所有用品均需要高温高压,以灭活残余的DNA酶. 2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制. 3. 用大口滴管或吸头操作,以尽量减少打断DNA的可能性. 4. 用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern 杂交、PCR等）目的.如要求更高,可参考有关资料进行DNA纯化.

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