接种果蝇时应该注意什么

实验二 果蝇杂交实验

1. 实验目的

通过实验验证分离规律，自由组合规律和连锁互换规律等遗传学的基本规律，掌握果蝇杂交的实验技术，了解普通果蝇的生活史及一些突变型的表现性状。在实验中熟练运用生物统计的方法对实验数据进行分析。

2. 实验原理

普通果蝇（Drosophila melanogaster）是双翅目的昆虫，它的生活史从受精卵开始，经历幼虫、蛹和成虫阶段，因此是一个完全变态的过程。果蝇中有许多突变类型，据不完全统计突变性状有四百多种，这些突变型大多属于形态突变，如白眼、残翅、黄体等，因此很容易进行观察。果蝇体型小，在培养瓶内易于人工饲养。而其繁殖力很强，在适宜的温度和营养条件下每只受精的雌蝇可产卵400个左右，每2个星期就可完成1个世代，因此在短时间内就可以获得大量的子代。此外，由于果蝇具有多线染色体以及生活史不同发育阶段的特点和基因组结构特点使其成为生物学研究中的模式生物，同时在遗传学研究中得到广泛而深入的研究。

本实验中教师提供给学生多种突变类型的果蝇，学生经过实验小组的讨论决定使用哪些类型和具体实验方案。因此整个实验过程是在完全开放状态下进行，实验过程中涉及到基因的显隐性、连锁、上位等多种关系，同时会得出一些与期望值不同的结果。要求学生在一段时间内安排好实验进程，如实记录实验中出现的现象和问题，并作出自己的分析和判断。

3. 实验用具及材料

双筒解剖镜、麻醉瓶、毛笔、白瓷板、普通果蝇野生型及不同突变型果蝇、乙醚、玉米粉、糖、酵母粉、琼脂等。

4. 实验方法及步骤

1）普通果蝇的生活史及形态观察

（1）生活史观察

①卵 成熟的雌蝇交尾后（2～3d）将卵产在培养基的表层。用解剖针的针尖在果蝇培养瓶内沿着培养基表面挑取一点培养基将其置于载玻片上，然后滴上1滴清水，用解剖针将培养基展开后放在显微镜低倍镜下仔细进行观察。果蝇的卵为椭圆形，长约0.5mm，腹面稍扁平，前端伸出的触丝可使卵附着在培养基表层而不陷入深层。

②幼虫 果蝇的受精卵经过一天的发育即可孵化为幼儿虫。幼虫在培养基内及瓶壁上都有，培养基内的幼虫一般要小一些。这是因为果蝇的幼虫从一龄幼虫开始经两次蜕皮，形成二龄和三龄幼虫，随着发育而不断长大，三龄幼虫往往爬到瓶壁上来化蛹，其长度可达4～5mm。幼虫一端稍尖为头部，黑点处为口器。幼虫在培养基内和瓶壁上蠕动爬行。

③蛹 幼虫经过4～5d的发育开始化蛹。一般附着在瓶壁上，颜色淡黄。随着发育的继续，蛹的颜色逐渐加深，最后为深褐色。在瓶壁上看到的几乎透明的蛹是已经羽化完而遗留的蛹的空壳。

④成虫 刚羽化出的果蝇虫体较长，翅膀也没有完全展开，体表未完全几丁质化所以成半透明透乳白色。随着发育，身体颜色加深，体表完全几丁质化。羽化出的果蝇在8～12h后开始交配，成体果蝇在25℃条件下的寿命为37d。

2）雌雄鉴别

为了准确地配制果蝇的杂交组合和果蝇遗传性状分析，必须首先能够正确辨别果蝇的性别。

①麻醉 对果蝇实施麻醉是为了便于性状观察和转移果蝇，因此麻醉时一定要根据实验目的的而确定麻醉的深度。如果只是进行观察，可以将果蝇麻醉至死。死亡时表现为翅膀与身体呈45度角。但如果是麻醉鉴别后再进行转移培养，就应避免麻醉至死。麻醉时，在麻醉瓶的瓶盖内塞入沾有乙醚的棉花，待乙醚气体在瓶内充满后将果蝇培养瓶的瓶口与麻醉瓶口对准，将果蝇转入麻醉瓶内，盖好瓶盖。观察果蝇的表现，若果蝇从瓶壁上纷纷落到瓶底，表示麻醉已生效。转移麻醉后的果蝇时，应用毛笔的笔尖粘取。

②将麻醉后的果蝇放在解剖镜下仔细观察，区别雌雄的差异。

可以着重从以下几方面观察雌雄果蝇主要差异，见表4-1。

表4-1 雌雄果蝇主要差异比较

雌蝇
雄蝇

体型较大

腹部椭圆型末端稍尖

腹部背面5条黑纹

无性梳
体型较小

腹部末端钝圆

腹部背面3条黑纹

最后一条延伸至腹面成一黑斑

第一对足第一跗节有性梳

在雌雄差异中，以性梳的差异最为准确。如刚羽化出的果蝇（图4-3），身体都较和长，颜色很浅。但是，用性梳的有无就可以很快将雌雄分开，在熟练操作几次后，就可以不必借助解剖镜也能很快区分雌雄。在观察性梳时可以用解剖镜观察，也可以用低倍的显微镜观察。

3)突变型观察

将果蝇麻醉后，在解剖镜下仔细辨认各种突变类型。与野生型果蝇作对照，观察突变型果蝇的性状表现，如残翅、黑身、黄身、白眼等。经过一段时间的练习，可以直接区别各种不同性状。

果蝇中的一些突变性状和控制该性状的基因如表4-2。

表4-2 果蝇中的一些突变性状及控制流性状的基因

突变型
基因符号
表现特征
基因所在染色体

白眼

棒眼

褐色眼

猩红眼

黑檀体

黄体

焦毛

黑体

匙形翅

残翅

翻翅

短翅
w

B

bw

st

c

y

sn

b

nub2

vg

Cy

m
复眼白色

复眼条形

小眼数少

复眼褐色

复眼猩红色

身体乌木色

身体浅橙黄色

刚毛卷曲烧曲焦状

颜色比黑檀体深

翅小匙状

翅退化，不能飞

翅向上翻卷，纯合致死

翅膀短小，不超过身体
X

X

II

III

III

X

X

II

II

II

II

X

4）配制培养基

培养果蝇用的容器可以采用较粗的指管或用广口瓶，这些容器均需在实验前进行高温灭菌才能使用。可以按如下成分进行培养基的配制：

玉米粉 28g 糖 22g

琼脂 2.5g 酵母粉 2.5g

水 250ml 丙酸 2ml

将上述成分（除酵母和丙酸）放在一烧杯内混合在一起，在电炉上加热，不断用玻璃棒搅拌以免将玉米粉煮糊。煮沸后将烧杯从电炉上取下，稍放置冷却一会儿，将酵母和丙酸加入，用玻璃棒搅拌均匀后分装到5个经高温灭菌的培养瓶内，塞好棉塞备用。注意在分装时不要把培养基倒在瓶壁上。刚配制完的培养基放凉后在瓶壁上会有许多水滴，这时如果把果蝇放进去，水滴可能将果蝇的翅膀粘住，为避免发生此事，可将配好的培养基放在温箱内2～3d，待水分蒸发后再使用，或用酒精棉将瓶壁上的水分擦掉。

5）选处女蝇

用于杂交的亲本雌蝇应该是没有交尾的处女蝇，这样才能保证杂交结果按照实验者所设计的路线进行。那么如何才能得到处女蝇呢？一般来说，刚羽化出来的果蝇在12h之内是不进行交配的，所以在这段时间内选出的雌蝇即为处女蝇。为了保险起见，可以在羽化后的8h内挑选。因此，在杂交实验开始的一段时间内，各实验小组要根据自己的实验设计，精心挑选处女蝇。为了操作方便，可以在每天晚上22：00～23：00将培养瓶内的成蝇杀死，次日早晨8：00～9：00对新羽化出的果蝇进行挑选。

6）配制杂交组合

按照所设计的杂交组合，如白眼♀×红眼♂选出白眼处女雌蝇2～3只，红眼雄蝇5～7只共同放入一个培养瓶内。在培养瓶上贴好标签，注明杂交内容、日期、实验组号等，然后将培养瓶放入25℃的培养箱内进行培养。如果温度适宜，也可在实验室的窗台上放置培养。

7）当发现培养瓶内有蛹出现后应及时将亲本处死以防发生回交

当有F1个体现后，观察其表型，注意显、隐性关系并计数统计。在一个新的培养瓶内放入5对F1配成F1×F1，此时不需要选处女蝇。当看到培养瓶内有蛹出现时，将亲本处死。F2果蝇出现后，进行观察统计，观测数目在200只以上。按照所配制的杂交组合，提出理论假设并根据实验结果进行X2检验。

注意：无论是对F1还是对F2进行统计，都要及时进行，避免陆续羽化出的果蝇在培养瓶内交尾后将卵产在培养基内。因此要求实验者不断进行观察，只要有新羽化出的果蝇就要及时取出并进行统计和观察。

5. 作业及思考题

（1）你如何能准确鉴定果蝇的雌雄个体？要领是什么？

（2）果蝇的生活史分几个阶段，你所观察到的不同类型的果蝇在整个生活史阶段有什么差异？

（3）配制果蝇培养基时应注意什么问题？

（4）仔细观察杂交过程果蝇过程的行为。

（5）记录实验结果，运用统计学方法对实验结果进行分析。你的结果与期望值相符吗？分析实验中出现的问题。

（6）你在实验中有什么新的发现？如何进行解释？

参考文献

1. 王亚馥，戴灼华。遗传学，北京：高等教育出版社，1999。

2. Leand H, Leroy H, Michael L G. Gegetics. McGraw-Hill companies, 2000

3. Graf U, and N. Van Schaik. Drosophila genetics: A preactical course. New york: springer Verlag, 1992.