水中大肠杆菌的测定实验步骤

出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法
Method for examination of coliform，fecal coliform and escherichia coli in food for export
SN 0169—92
代替ZB X09 002—86
1 主题内容与适用范围
本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。
本标准适用于出口食品的检验。
2 设备和材料
2.1 吸管：1mL，具0.1mL刻度；5mL和10mL，具1mL刻度。
2 2 水浴箱：44.5±0.5℃。
2.3 培养箱：36±1℃，44.5±0.5℃。
2.4 冰箱：0～5℃和-15～-20℃。
2.5 均质器。
2.6乳钵和研棒。
2.7 平皿：直径90mm。
2.8天平：感量0.1g。
2.9 显微镜。
2.10 稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。
2.11 玻璃珠：直径约5mm。
2.12菌落计数器。
3 培养基及试剂
3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白 (LST)肉汤。
3.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。
3.3 EC肉汤。
3.4 伊红美蓝琼脂(EMB)。
3.5营养琼脂斜面。
3.6 色氨酸肉汤。
3.7 MR-VP培养基。
3.8 Korser氏枸椽酸盐肉汤。
3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。
3.10 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。
3.11 生理盐水。
3.12 革兰氏染色液。
3.13 Kovacs氏靛基质试剂。
3.14 甲基红指示剂。
3.15 Voges—pros kauer(V—P)试剂。
4 样品制备
4.1 以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检验，应将冷冻样品置于-15℃保存；非冷冻而易腐的食品，应置于4℃冰箱保存。检验前冷冻样品可于2—5℃18h内解冻，或在45℃以下15min内解冻。
4.2 不同食品样品匀液的制备
4.2.1 液体食品
以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇)，制成1：10的样品匀液。
4.2.2 固体和半固体食品
以无菌操作取25g样品，放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r／min均质1～2min，制成1：10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。
4.3 稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计，用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液，如10-2、10-3、10-4.………。从制备样品匀液至稀释完毕，全过程不得超过15min。
5 大肠菌群的测定
5.1 大肠菌群MPN值的测定
5.1.1 对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白 (LST)肉汤，每管接种1mL。
5.1.2 将接种管置于36±1℃培养48±2h。
5.1.3 观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生，记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则进一步作证实试验。
5.2 大肠菌群的证实试验
5.2.1 将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中。
5.2.2 置BGLB肉汤管于36±1℃培养48±2h。
5.2.3 记录所有BGLB肉汤管的产气管数。
5.2.4 结果报告：按BGLB肉汤产气管数，查MPN表(见附录B(补充件))报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN值。
6 粪大肠菌群测定
6.1 用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。
6.2 将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内，培养24±2h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。
6.3 记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。
6.4 结果报告：按产气管数，查MPN表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌群的MPN值。
7 大肠杆菌测定
7.1 将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h，取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板，36±1℃培养24±2h。
7.2 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
7.3 如有典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面上，36±1℃培养18～24h。
7.4 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。
7.4.1 色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后，加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL，上层出现红色为靛基质阳性反应。
7.4.2 MR—VP培养基；在36±1℃培养48±2h。以无菌操作移取培养物1mL至13mm×l00mm试管中，加5％ɑ—萘酚乙醇溶液0.6mL，40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h，如出现伊红色，为VP试验阳性。
将MR—VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。如培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。
7.4.3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长。
7.4.4 LST肉汤：于30±1℃培养48±2h，观察试管中是否产气。
7.4.5 革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。
7.4.6 大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：
靛基质 MR VP 枸椽酸盐 鉴定（型别）
+ + - - 典型大肠杆菌
- + - - 非典型大肠杆菌
+ + - + 典型中间型
- + - + 非典型中间型
- - + + 典型产气肠杆菌
+ - + + 非典型产气肠杆菌
如出现上表以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。
7.5 结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气，IMViC试验为++--或-+--，再根据LST肉汤阳性管数查MPN表，报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN值。
8 大肠菌群固体培养基测定法
8.1 样品制备同第4章。
8.2 计数
8.2.1 选取适宜的三个连续稀释度的样品液，每个稀释度接种两个灭菌平皿，每皿1mL。另取lmL稀释剂加入一个灭菌平皿中，作空白对照。
8.2.2 将冷至45±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)10～15mL倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀。
8.2.3 待琼脂凝固后，再加3～4mLVRBA覆盖平板表层。
8.2.4 翻转平板，置于36±l℃培养18～24h。
8.2.5 选用有30～150个菌落的平板，计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为0.5mm或更大。
8.2.6 证实
8.2.6.1 从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，移种于BGLB肉汤管内，36±1℃培养24h和48h，观察产气情况。
8.2.6.2 将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管，应进行革兰氏染色，以便排除革兰氏阳性杆菌。
8.2.7 结果报告
经最后证实为阳性(产气，革兰氏阴性杆菌)的试管百分比乘以于8.2.5条中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克(毫升)样品中大肠菌群数。
例：10-4样品稀释液lmL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：
100×6／10×104／g(mL)＝6.0×105／g(mL)
附 录 A
培养基和试剂
(补充件)
A1 月桂基硫酸盐胰蛋白 （LST）肉汤
胰蛋白 或胰酪胨(Trypticase)
20g
氯化钠 5.0g
乳糖 5.0g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.75g
磷酸二氢钾(KH2P04) 2.75g
月桂基硫酸钠 0.1g
蒸馏水 1000.0mL
将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH6.8±0.2。
A2 煌绿乳糖胆盐(BGAB)肉汤
蛋白胨 10.0g
乳糖 10.0g
牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液 200.0mL
0.1％煌绿水溶液 13.3mL
蒸馏水
将蛋白胨乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，pH7.0～7.5)，用蒸馏水稀释到975mL，调pH7.4。再加入0.1％煌绿水溶液13.3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到20mm×l50mm试管(管内有倒立的小发酵管)中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH7.2±0.1。
A3 EC肉汤
胰蛋白 或胰酪
20.0g
3号胆盐或混合胆盐 1.5g
乳糖 5.0g
磷酸氢二钾(KH2P04) 4.0g
磷酸二氢钾(KH2P04) 1.5g
氯化钠 5.0g
蒸馏水 1000.0mL
将以上成分溶解于蒸馏水中，分装16mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管)，每管8mL。
121℃高压灭菌15min，最终pH6.9±0。1。
A4 伊红美蓝琼脂(EMB)
蛋白胨 10.0g
乳糖 10.0g
磷酸氢二钾(KH2P04) 2.0g
琼脂 15.0g
伊红γ(水溶性) 0.4g或2％水溶液20mL
美蓝0.065g或0.5％水溶液 13mL
蒸馏水 1000.0mL
在1 000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂，加水补足至原量。分装于三角烧瓶中。每瓶100mL或200mL，高压灭菌15min。最终pH7.1±0.2。使用前将琼脂融化，于每100mL琼脂中加5mL灭菌的20％乳糖水溶液、2mL的2％伊红γ水溶液和1.3mL0.5％的美蓝水溶液，摇匀，冷至45～50℃倾注平皿。
A5 营养琼脂斜面
牛肉膏 3.0g
蛋白胨 5.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000.0mL
将各成分加于蒸馏水中，煮沸溶解。分装合适的试管。121℃高压灭菌15min。最终pH7.3±0.1。灭菌后摆成斜面备用。
A6 色氨酸肉汤
胰胨或胰酪胨 10.0g
蒸馏水 1000.0mL
加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。分装试管，每管5mL。121℃高压灭菌15min。最终pH6.9±0.2。
A7 MR-VP培养基
胨
7.0g
葡萄糖 5.0g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 5.0g
蒸馏水 1000.0mL
将各成分溶于蒸馏水中，分装试管，121℃高压灭菌15min，最终pH6.9±0.2。
A8 Koser氏枸椽酸盐肉汤
磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4�6�14H2O) 1.5g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 1.0g
硫酸镁(MgSO4�6�17H2O) 0.2g
枸椽酸钠(含2H2O) 3.0g
蒸馏水 1000.0mL
将各成分溶解于蒸馏水中，分装试管，每管10mL，121℃高压灭菌15min。最终pH6.7±0.2。
A9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)
蛋白胨 7.0g
酵母膏 3.0g
乳糖 10.0g
氯化钠 5.0g
胆盐或3号胆盐 1.5g
中性 0.03g
结晶紫 0.002g
琼脂 15～18g
蒸馏水 1000.0mL
将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调至pH7.4±0.1。煮沸2min，将培养基冷 45～50℃倾注平板。临用时制备，不得超过3h。
A1O Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液
贮存液
磷酸二氢钾(K2HPO4) 34.0g
蒸馏水 500mL
将磷酸二氢钾溶于蒸馏水中，用lmol／L氢氧化钠约175mL调至pH7.2。用蒸馏水加至1000mL贮存于冰箱。稀释液取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于合适容器后，121℃高压灭菌15min。
A11 生理盐水
氯化钠 8.5g
蒸馏水 1000.0mL
将氯化钠溶于蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
A12 革兰氏染色液
结晶紫染色液：
结晶紫 1.0g
95％乙醇 20.0mL
1％草酸铵水溶液 80.OmL
将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
革兰氏碘液：
碘 1.0g
碘化钾 2.0g
蒸馏水 300.0mL
将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。
沙黄复染液：
沙黄 0.25g
95％乙醇 10.0mL
蒸馏水 90.0mL
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
染色法
a. 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗。
b. 滴加革兰氏碘液，作用lmin，水洗。
c. 滴加95％乙醇脱色约15～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。
d 滴加复染液，复染lmin，水洗、待干、镜检。
结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
A13 Kovacs氏靛基质试剂
对二甲氨基苯甲醛 5.0g
戊醇 75.0mL
盐酸(浓) 25.0mL
将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中，然后慢慢加入浓盐酸即可。
A14 甲基红指示剂
甲基红 0.1g
95％乙醇 300mL
将甲基红溶解于300mL乙醇中，加水稀释至500mL。
A15 Voges—Proskauer(V—P)试剂
甲液
a-萘酚 5.0g
无水乙醇 100.0mL
乙液
氢氧化钾 40.0g
用蒸馏水加 100.OmL
附 录 B
1g检样中最近似值(MPN)表
(补充件)
使用三管法，接种量分别为0.1，0.01和0.00lg。
阳性管数 MPN 阳性管数 MPN
0.1 0.01 0.001 0.1 0.01 0.001
0 0 0 <3 2 0 0 9.1
0 0 1 3 2 0 1 14
0 0 2 6 2 0 2 20
0 0 3 9 2 0 3 26
0 1 0 3 2 1 0 15
0 1 1 6.1 2 1 1 20
0 1 2 9.2 2 1 2 27
0 1 3 12 2 1 3 34
0 2 0 6.2 2 2 0 21
0 2 1 9.3 2 2 1 28
0 2 2 12 2 2 2 35
0 2 3 16 2 2 3 42
0 3 0 9.4 2 3 0 29
0 3 1 13 2 3 1 36
0 3 2 16 2 3 2 44
0 3 3 19 2 3 3 53
1 0 0 3.6 3 0 0 23
1 0 1 7.2 3 0 1 39
1 0 2 11 3 0 2 64
1 0 3 15 3 0 3 95
1 1 0 7.3 3 1 0 43
1 1 1 11 3 1 1 75
1 1 2 15 3 1 2 120
1 1 3 19 3 1 3 160
1 2 0 11 3 2 0 93
1 2 1 15 3 2 1 150
1 2 2 20 3 2 2 210
1 2 3 24 3 2 3 290
1 3 0 16 3 3 0 240
1 3 1 20 3 3 1 460
1 3 2 24 3 3 2 1100
1 3 3 29 3 3 3 >1100
注：①本表采用3个稀释度[0.1g(mL)、0.0lg(mL)和0.001g(mL)]，每个稀释度接种3管。
②表内所列检样量如改用1g(mL)、0.18(mL)和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍：如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)时，则表内数字应相应增加10倍，其余类推。

1、配制培养基：在培养皿中配制伊红美蓝固体培养基。一式三到五份。
2、水样稀释：均匀稀释。
3、接种并培养。
4、观察每个培养皿中的大肠杆菌的菌落（在伊红-美蓝培养基上，大肠杆菌菌落特征鲜明）数。取均值，即得实际值。这个菌落数就对应原水样中大肠杆菌的个数。