限制酶的识别位点大多是反向对称的,如果只用用同种酶切,所得片段的2端序列相同,在连接时,是随机连接,不仅会出现反向连接,而且会出现片段串联.
在分子克隆实验中,我们会用两种酶分别切目的基因和质粒的上下游,这样就保证了目的片段和质粒片段在连接时的方向性,如上游都用EcoR I,下游都用BamH.
你所理解的“目的基因与质粒不就是本应该用同一种限制酶切割”,指的就是两者上游同用一种,下游又同用另一种,而不是指上下游都用同一种酶切.
除非是某些特殊情况,不得不用一种酶切上下游,这样会出现大量的反向连接,连接后,需要多挑些克隆鉴定.
个人见解,仅供参考,祝好!
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