你这个基因工程学的挺深的,如果不是必要的考试内容,建议不要这么深究,你可能会很累。
简单给你说说你的问题吧。
限制性内切酶在细菌中的作用,类似于细菌的免疫系统,是为了切断外源物基因的,是一种排它机制,进化筛选决定了此种酶的切割位点,在自身的质粒中不存在(其实也不完全是不存在),也就不切割自身的质粒了。
你的第二个问题,概念混淆的太多,好好缕清一下思路,想想你的目的基因是用来做什么的,你说的ECOR1切割目的基因是为了什么,你所谓的受体菌,又是做什么用的。如果你只是这一个点不明确,那简单说就是,酶切位点的切割和目的基因的重连,破坏了原有酶切位点,原酶自然失效。
第三个问题,天然质粒能不能做载体,其实就是天然质粒和载体的区别,你想想细菌质粒的功能,比如一些毒力基因、这对载体是无用的,即去除,再比如缺少适当的多克隆位点,这对插入重组不利,再比如缺少针对性筛选标记,这又对转化菌株的筛选不利了,如果是表达载体,还缺少相应的操纵子,这对基因的表达的必须的。
1、在一个活细胞内,限制酶是被一层特殊的生物膜包裹着的,所以限制酶不会切割自身的质粒,就像人体细胞的溶酶体中有很多溶解酶,可以将外来的东西分解掉,但他就是不会分解人体自身的细胞组织。再比如说警察用枪可以打死人,但他不打自己的好人。
2.天然质粒不能直接作为载体,需要人工改造,有什么需要改造的?
天然质粒分子量小,有许多酶切位点,但有时候需要他的分子量更小,或者需要他没有的酶切位点,这时就要改造。改造方法:增减分子量,增或减酶切位点的种类或个数,改变质粒的自身性质,如非极性,以便更容易穿过细胞膜。
1、限制酶用于切割外源性的DNA, 尤其是病毒DNA。在细菌里面,细菌自己的DNA被自身的酶甲基化了,不会被限制性内切酶所识别,而外源性DNA没有经过甲基化的处理, 会被切除。
2、改造的目的是要质粒含有需要的切割位点和相应的标记基因,还需要考虑复制原点、启动子和终止子的构建。