不同的PCR MIX所设置的退火温度是不一样的，有的比最低Tm值低5℃，有的低3℃，请你参考你所买的PCR MIX的说明书，上面肯定有详细说明。一般PCR比最低Tm值低1-5℃，都没什么问题。RT-PCR的文献上，有推荐的设计软件，也有推荐的PCR MIX，跟着说明书做就没有问题了。
