【步骤】
(1)用吸管吸掉96孔板内的培养液,用PBS冲洗3遍,加入含25mmol/L二乙醇胺,1mmol/L氯化镁和6.7mmol/L PNPP的反应液。
(2)每孔150ul.37℃避光放置半小时,然后加0.1mol/L氢氧化钠100ul终止反应,用酶标仪于405nm波长下测定OD值.
(3)样品OD值在ALP标准曲线上读取酶活性值(U/L).
ALP标准曲线绘制:
取PNP0.0111克用三蒸水溶解后稀释至250ml,此时PNP的浓度为320umol/L.依次稀释到160 umol/L,80umol/L,40umol/L,20umol/L,10umol/L和5mol/L.相当于ALP1280 U/L,640U/L,320U/L,160U/L,80U/L,40U/L和20U/L(活性值).用酶标仪于405nm波长下测定PNP的OD值.以ALP活性值作为自变量,对应的OD值作为应变量,求得直线回归方程.
【结果】测定碱性磷酸酶的含量
还有其他方法来测定,比如
以ALP为目标物的检测方法有
1 Gomori钙钴法
2偶氮偶联法
3碱性磷酸酶染色试剂盒法。
4.PNPP偶氮法
5. BCIP/NBT比色法
6 茜素红法
7. von Kossa法