电泳检查你的流穿液，对比上样前的样品，确信蛋白石结合到柱上
你his-tag的包涵体蛋白，用尿素洗脱，其pH值是多少？需要用低pH；如果pH不够，极可能你的蛋白还在柱上。
此外，你有没尝试过柱上复性，以避免用尿素洗脱？
把纯化前后的各组分在同一张胶片上跑，确认下蛋白是在穿透里还是在柱子上没有洗脱下来，如果是在柱子上可以尝试更低的pH,比如3.5，或者使用咪唑梯度洗脱。
排除法吧
1.电泳问题
2.纯化过程降解
3.Ni柱吸附了所有蛋白，洗脱液有没有问题？
我也是这种情况，请问什么是流穿液啊
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