苯甲酸的检测方法是什么?

苯甲酸外观为白色结晶体，有安息香或苯甲气味，其蒸气具有很强刺激性，主要用作食品添加剂，具有抑制食品中微生物繁殖或杀灭、防止食品腐败变质、保持食品鲜度作用。但若过量添加，不仅能破坏维生素B1，还能使钙形成不溶性物质，影响人体对钙的吸收，同时对胃肠道有刺激作用；过量食用可诱发癌症，长期使用可诱发哮喘、荨麻疹及血管性水肿等变态反应，对人体健康造成不利影响。
近年来，食品安全已成为全社会共同关注热点。苯甲酸作为食品添加剂，我国GB2760–1996《食品添加剂使用卫生标准》规定其使用限量应＜0.1g/kg，故有关苯甲酸含量检测研究也备受关注。
1·高效液相色谱法
高效液相色谱是从20世纪60年代后期开始发展起来的，具有填料颗粒小、且均匀，小颗粒具有高柱效特点，该法是目前应用最多一种色谱分析方法。与经典液相色谱相比，其优点是分辨率高、灵敏度高、样品量少、易回收和色谱柱可重复使用等。
液相色谱法除可检测乳制品中苯甲酸含量，还能测定其在其它食品中含量。采用高效液相色谱法测定巴西食品中苯甲酸含量。分别将饮料、果汁、黄油及奶酪等食品进行粉碎处理，然后与蒸馏水混合，再用氢氧化钠溶液将pH值调为碱性，最后离心处理，取上层清液进行反相色谱法测定，其检测精密度和准确度均能满足分析要求。Liu等〔5〕采用液相色谱仪测定面粉和油炸食品中苯甲酸含量，样品经乙醇超声破碎后提取苯甲酸，然后用C18柱进行梯度洗脱。经实验测得苯甲酸线性检出范围为0.50~15.06mg/L，最低检出限为0.22 mg。
2·毛细管电泳法
毛细管电泳（简称CE），是上世纪80年代初发展起来一种新型高效分离技术。以毛细管为分离通道，以高压支流电场为驱动力，通常使用内径为25，000~100，000 nm弹性涂层熔融石英管。该毛细管特点是容积小、侧截比大，可用自由溶液或凝胶等为支持介质，在溶液介质下能产生平面状电流场.该法具有高效、快速、样品量少、测定成本低等优点。

苯甲酸为具有苯或甲醛的气味的鳞片状或针状结晶。熔点122.13℃，沸点249℃，相对密度1.2659（15/4℃）。在100℃时迅速升华，它的蒸气有很强的刺激性，吸入后易引起咳嗽。微溶于水，易溶于乙醇、乙醚等有机溶剂。苯甲酸是弱酸，比脂肪酸强。
它们的化学性质相似，都能形成盐、酯、酰卤、酰胺、酸酐等，都不易被氧化。苯甲酸的苯环上可发生亲电取代反应，主要得到间位取代产物。

【GB/T 5009.29—1996】

食品中山梨酸、苯甲酸的测定方法

1 主题内容与适用范围
本标准规定了酱油、水果汁、果酱等食品中山梨酸、苯甲酸含量的测定方法。
本标准适用于酱油、水果汁、果酱等食品中山梨酸、苯甲酸含量的测定。
最低检出浓度：气相色谱法最低检出量为1μg，用于色谱分析的样品为1g时，最低检出浓度为1mg/kg。
第一篇 气相色谱法(第一法)
2 原理
样品酸化后，用乙醚提取山梨酸、苯甲酸，用附氢火焰离子化检测器的气相色谱仪进行分离测定，与标准系列比较定量。
3 试剂
3.1 乙醚：不含过氧化物。
3.2 石油醚：沸程30～60℃。
3.3 盐酸。
3.4 无水硫酸钠。
3.5 盐酸(1＋1)：取100mL盐酸，加水稀释至200mL。
3.6 氯化钠酸性溶液(40g/L)：于氯化钠溶液(40g/L)中加少量盐酸(1＋1)酸化。
3.7 山梨酸、苯甲酸标准溶液：准确称取山梨酸、苯甲酸各0.2000g，置于100mL容量瓶中，用石油醚—乙醚(3＋1)混合溶剂溶解后并稀释至刻度。此溶液每毫升相当于2.0mg山梨酸或苯甲酸。
3.8 山梨酸、苯甲酸标准使用液：吸取适量的山梨酸、苯甲酸标准溶液，以石油醚－乙醚(3＋1)混合溶剂稀释至每毫升相当于50，100，150，200，250mg山梨酸或苯甲酸。
4 仪器
气相色谱仪：具有氢火焰离子化检测器。
5 分析步骤
5.1 样品提取
称取2.50g事先混合均匀的样品，置于25mL带塞量筒中，加0.5mL盐酸(1＋1)酸化，用15，10mL乙醚提取两次，每次振摇1min，将上层乙醚提取液吸入另一个25mL带塞量筒中。合并乙醚提取液。用3mL氯化钠酸性溶液(40g/L)洗涤两次，静止15min，用滴管将乙醚层通过无水硫酸钠滤入25mL容量瓶中。加乙醚至刻度，混匀。准确吸取5mL乙醚提取液于5mL带塞刻度试管中，置40℃水浴上挥干，加入2mL石油醚－乙醚(3＋1)混合溶剂溶解残渣，备用。
5.2 色谱参考条件
5.2.1 色谱柱：玻璃柱，内径3mm，长2m，内装涂以5%(m/m)DEGS＋1%(m/m)H3PO4固定液的60～80目Chromosorb W AW。
5.2.2 气流速度：载气为氮气，50mL/min(氮气和空气、氢气之比按各仪器型号不同选择各自的最佳比例条件)。
5.2.3 温度：进样口230℃；检测器230℃；柱温170℃。
5.3 测定
进样2μL标准系列中各浓度标准使用液于气相色谱仪中，可测得不同浓度山梨酸、苯甲酸的峰高，以浓度为横坐标，相应的峰高值为纵坐标，绘制标准曲线。
同时进样2μL样品溶液。测得峰高与标准曲线比较定量。
5.4 计算

式中：X1——样品中山梨酸或苯甲酸的含量，g/kg；
m1——测定用样品液中山梨酸或苯甲酸的质量，μg；
V1——加入石油醚－乙醚(3＋1)混合溶剂的体积，mL；
V2——测定时进样的体积，μL；
m2——样品的质量，g；
5——测定时吸取乙醚提取液的体积，mL；
25——样品乙醚提取液的总体积，mL。
由测得苯甲酸的量乘以1.18，即为样品中苯甲酸钠的含量。
结果的表述：报告算术平均值的二位有效数。
5.5 允许差
相对相差≤10%。
5.6 其他
在色谱图中山梨酸保留时间为2分53秒；苯甲酸保留时间为6分8秒。
（图略）
第二篇 高效液相色谱法(第二法)
6 原理
样品加温除去二氧化碳和乙醇，调pH至近中性，过滤后进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性和定量。
7 试剂
方法中所用试剂，除另有规定外，均为分析纯试剂，水为蒸馏水或同等纯度水，溶液为水溶液。
7.1 甲醇：经滤膜(0.5μm)过滤。
7.2 稀氨水(1＋1)：氨水加水等体积混合。
7.3 乙酸铵溶液(0.02mol/L)：称取1.54g乙酸铵，加水至1000mL，溶解，经滤膜(0.45μm)过滤。
7.4 碳酸氢钠溶液(20g/L)：称取2g碳酸氢钠(优级纯)，加水至100mL，振摇溶解。
7.5 苯甲酸标准储备溶液：准确称取0.1000g苯甲酸，加碳酸氢钠溶液(20g/L)5mL，加热溶解，移入100mL容量瓶中，加水定容至100mL，苯甲酸含量为1mg/mL，作为储备溶液。
7.6 山梨酸标准储备溶液：准确称取0.1000g山梨酸，加碳酸氢钠溶液(20g/L)5mL，加热溶解，移入100mL容量瓶中，加水定容至100mL，山梨酸含量为1mg/mL，作为储备溶液。
7.7 苯甲酸、山梨酸标准混合使用溶液：取苯甲酸、山梨酸标准储备溶液各10.0mL，放入100mL容量瓶中，加水至刻度。此溶液含苯甲酸、山梨酸各0.1mg/mL。经滤膜(0.45μm)过滤(同时测定糖精钠时可加GB/T 5009.28中3.4糖精钠标准储备溶液)。
8 仪器
高效液相色谱仪(带紫外检测器)。
9 分析步骤
9.1 样品处理
9.1.1 汽水：称取5.00～10.0g样品，放入小烧杯中，微温搅拌除去二氧化碳，用氨水(1＋1)调pH约7。加水定容至10～20mL，经滤膜(0.45μm)过滤。
9.1.2 果汁类：称取5.00～10.0g样品，用氨水(1＋1)调pH约7，加水定容至适当体积，离心沉淀，上清液经滤膜(0.45μm)过滤。
9.1.3 配制酒类：称取10.0g样品，放入小烧杯中，水浴加热除去乙醇，用氨水(1＋1)调pH约7，加水定容至适当体积，经滤膜(0.45μm)过滤。
9.2 高效液相色谱参考条件
9.2.1 色谱柱：YWG－C184.6mm×250mm10μm不锈钢柱。
9.2.2 流动相：甲醇：乙酸铵溶液(0.02m0l/L)(5：95)。
9.2.3 流速：1mL/min。
9.2.4 进样量：10μL。
9.2.5 检测器：紫外检测器，波长230μm，灵敏度0.2AUFS。
根据保留时间定性，外标峰面积法定量。
9.3 计算

式中：X2——样品中苯甲酸或山梨酸的含量，g/kg；
m3——进样体积中苯甲酸或山梨酸的质量，mg；
V4——进样体积，mL；
V3——样品稀释液总体积，mL；
m4——样品质量，g。
结果的表述：报告算术平均值的二位有效数。
9.4 允许差：相对相差≤10%。
9.5 其他
同GB/T 5009.28的5.6。
注：本方法可同时测定糖精钠。
第三篇 薄层色谱法(第三法)
10 原理
样品酸化后，用乙醚提取苯甲酸、山梨酸。将样品提取液浓缩，点于聚酰胺薄层板上，展开。显色后，根据薄层板上苯甲酸、山梨酸的比移值，与标准比较定性，并可进行概略定量。
11 试剂
11.1 异丙醇。
11.2 正丁醇。
11.3 石油醚：沸程为30～60℃。
11.4 乙醚：不含过氧化物。
11.5 氨水。
11.6 无水乙醇。
11.7 聚酰胺粉：200目。
11.8 盐酸(1＋1)：取100mL盐酸，加水稀释至200mL。
11.9 氯化钠酸性溶液(40g/L)：于氯化钠溶液(40g/L)中加少量盐酸(1＋1)酸化。
11.10 展开剂。
11.10.1 正丁醇＋氨水＋无水乙醇(7＋1＋2)。
11.10.2 异丙醇＋氨水＋无水乙醇(7＋1＋2)。
11.11 山梨酸标准溶液：准确称取0.2000g山梨酸，用少量乙醇溶解后移入100mL容量瓶中，并稀释至刻度，此溶液每毫升相当于2.0mg山梨酸。
11.12 苯甲酸标准溶液：准确称取0.2000g苯甲酸，用少量乙醇溶解后移入100mL容量瓶中，并稀释至刻度，此溶液每毫升相当于2.0mg苯甲酸。
11.13 显色剂：溴甲酚紫－乙醇(50%)溶液(0.4g/L)，用氢氧化钠溶液(4g/L)调至pH＝8。
12 仪器
12.1 吹风机。
12.2 层析缸。
12.3 玻璃板：10cm×18cm。
12.4 微量注射器：10μL，100μL。
12.5 喷雾器。
13 操作方法
13.1 样品提取
称取2.50g事先混合均匀的样品，置于25mL带塞量筒中，加0.5mL盐酸(1＋1)酸化，用15，10mL乙醚提取两次，每次振摇1min，将上层醚提取液吸入另一个25mL带塞量筒中，合并乙醚提取液。用3mL氯化钠酸性溶液(40g/L)洗涤两次，静止15min，用滴管将乙醚层通过无水硫酸钠滤入25mL容量瓶中。加乙醚至刻度，混匀。吸取10.0mL乙醚提取液分两次置于10mL带塞离心管中，在约40℃的水浴上挥干，加入0.10mL乙醇溶解残渣，备用。
13.2 测定
13.2.1 聚酰胺粉板的制备：称取1.6g聚酰胺粉，加0.4g可溶性淀粉，加约7mL水，研磨3～5min，立即倒入涂布器内制成10cm×18cm、厚度0.3mm的薄层板两块，室温干燥后，于80℃干燥1h，取出，置于干燥器中保存。
13.2.2 点样：在薄层板下端2cm的基线上，用微量注射器点1μL、2μL样品液，同时各点1μL、2μL山梨酸、苯甲酸标准溶液。
13.2.3 展开与显色：将点样后的薄层板放入预先盛有展开剂(11.10.1或11.10.2)的展开槽内，展开槽周围贴有滤纸，待溶剂前沿上展至10cm，取出挥干，喷显色剂，斑点成黄色，背景为蓝色。样品中所含山梨酸、苯甲酸的量与标准斑点比较定量(山梨酸、苯甲酸的比移值依次为0.82，0.73)。
13.3 计算

式中：X3——样品中苯甲酸或山梨酸的含量，g/kg；
m5——测定用样品液中苯甲酸或山梨酸的质量，mg；
V5——加入乙醇的体积，mL；
V6——测定时点样的体积，mL；
m6——样品质量，g；
10——测定时吸取乙醚提取液的体积，mL；
25——样品乙醚提取液总体积，mL。
注：本方法还可以同时测定果酱、果汁中的糖精。
第四篇 禁用防腐剂定性试验(第四法)
14 硼酸、硼砂
14.1 试剂
14.1.1 盐酸(1＋1)：量取盐酸100mL，加水稀释至200mL。
14.1.2 碳酸钠溶液(40g/L)。
14.1.3 氢氧化钠溶液(4g/L)：称取2g氢氧化钠，溶于水并稀释至500mL。
14.1.4 姜黄试纸：称取20g姜黄粉末，用冷水浸渍4次，每次各100mL，除去水溶性物质后，残渣在100℃干燥，加100mL乙醇，浸渍数日，过滤。取1cm×8cm滤纸条，浸入溶液中，取出，于空气中干燥，贮于玻璃瓶中。
14.2 分析步骤
14.2.1 样品处理
称取3～5g固体样品，加碳酸钠溶液(40g/L)充分湿润后，于小火上烘干、炭化后再置高温炉中灰化。量取10～20mL液体样品，加碳酸钠溶液(40g/L)至呈碱性后，置水浴上蒸干、炭化后再置高温炉中灰化。
14.2.2 定性试验
14.2.2.1 姜黄试纸法：取一部分灰分，滴加少量水与盐酸(1＋1)至微酸性，边滴边搅拌，使残渣溶解，微温后过滤。将姜黄试纸浸入滤液中，取出试纸置表面皿上，于60～70℃干燥，如有硼酸、硼砂存在时，试纸显红色或橙红色，在其变色部分熏以氨即转为绿黑色。
14.2.2.2 焰色反应
取灰分置于坩埚中，加硫酸数滴及乙醇数滴，直接点火，硼酸或硼砂存在时，火焰呈绿色。
15 水杨酸
15.1 试剂
15.1.1 三氯化铁溶液(10g/L)。
15.1.2 亚硝酸钾溶液(100g/L)。
15.1.3 乙酸(50%)。
15.1.4 硫酸铜溶液(100g/L)。称取10g硫酸铜(CuSO4?H2O)，加水溶解至100mL。
15.2 分析步骤
15.2.1 样品提取
按GB/T 5009.28中9.1操作，将乙醚提取液蒸干后，残渣备用。
15.2.2 定性试验
15.2.2.1 三氯化铁法：残渣加1～2滴三氯化铁溶液(10g/L)，水杨酸存在时显紫堇色。
15.2.2.2 确证试验：溶解残渣于少量热水中，冷后加4～5滴亚硝酸钾溶液(100g/L)，4～5滴乙酸(50%)及1滴硫酸铜溶液(100g/L)，混匀，煮沸0.5h，放置片刻，水杨酸存在时呈血红色(苯甲酸不显色)。
附加说明：
本标准由卫生部卫生监督司提出。
本标准第一法由卫生部食品卫生监督检验所负责起草；第二法由天津食品卫生监督检验所、辽宁省食品卫生监督检验所、武汉市卫生防疫站、浙江省卫生防疫站、四川省卫生防疫站负责起草；第三、四法由卫生部食品卫生监督检验所负责起草。
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释