你的设计有没有问题？重叠那段的引物是连接的关键，而这段引物一般比较长，Tm不会只有59。建议用不对称PCR做第一轮，分别P出2个单链为主的产物，这样纯化容易；然后用2端引物扩第二轮。这时的退火温度不是低，而是比较高，因为跨链。所以两端的引物也要符合这点要求，不能太短。
试试把退火时间延长一些，看能不能把两条链连上。一般就是照着引物的Tm值做就可以的。
