微生物学实验室常用的灭菌方法有哪些

物理方法

1、温度

利用温度进行灭菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高温可使微生物细胞内的蛋白质和酶类发生变性而失活，从而起灭菌作用，低温通常起抑菌作用。

1 干热灭菌法：

a.灼烧灭菌法：利用火焰直接把微生物烧死。此法彻底可靠，灭菌迅速，但易焚毁物品，所以使用范围有限，只适合于接种针、环、试管口及不能用的污染物品或实验动物的尸体等的灭菌。

b.干热空气灭菌法：这是实验室中常用的一种方法，即把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，升温至160℃，恒温1小时即可。此法适用于玻璃皿、金属用具等的灭菌。

2 湿热灭菌法：

在同样的温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好，这是因为一方面细胞内蛋白质含水量高，容易变性。另一方面高温水蒸汽对蛋白质有高度的穿透力，从而加速蛋白质变性而迅速死亡。

a.巴氏消毒法：有些食物会因高温破坏营养成分或影响质量，如牛奶、酱油、啤酒等，所以只能用较低的温度来杀死其中的病原微生物，这样既保持食物的营养和风味，又进行了消毒，保证了食品卫生。该法一般在62℃，30分钟即可达到消毒目的。此法为法国微生物学家巴斯德首创，故名为巴氏消毒法。

b.煮沸消毒法：直接将要消毒的物品放入清水中，煮沸15分钟，即可杀死细菌的全部营养和部分芽孢。若在清水中加入1%碳酸钠或2%的石炭酸，则效果更好。此法适用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。

c.间歇灭菌法：上述两种方法在常压下，只能起到消毒作用，而很难做到完全无菌。若采用间歇灭菌的方法，就能杀灭物品中所有的微生物。具体做法是：将待灭菌的物品加热至100℃，15~30分钟，杀死其中的营养体。然后冷却，放入37℃恒温箱中过夜，让残留的芽孢萌发成营养体。第2天再重复上述步骤，三次左右，就可达到灭菌的目的。此法不需加压灭菌锅，适于推广，但操作麻烦，所需时间长。

d. 加压蒸汽灭菌法：这是发酵工业、医疗保健、食品检测和微生物学实验室中最常用的一种灭菌方法。它适用于各种耐热、体积大的培养基的灭菌，也适用于玻璃器皿、工作服等物品的灭菌。

加压蒸汽灭菌是把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的，以大量蒸汽使其中压力升高。由于蒸汽压的上升，水的沸点也随之提高。在蒸汽压达到1.055公斤/厘米2时，加压蒸汽灭菌锅内的温度可达到121℃。在这种情况下，微生物（包括芽孢）在15~20分钟便会被杀死，而达到灭菌目的。如灭菌的对象是砂土、石蜡油等面积大、含菌多、传热差的物品，则应适当延长灭菌时间。

在加压蒸汽灭菌中，要引起注意的一个问题是，在恒压之前，一定要排尽灭菌锅中的冷空气，否则表上的蒸汽压与蒸汽温度之间不具对应关系，这样会大大降低灭菌效果。

3 影响灭菌的因素：

a.不同的微生物或同种微生物的不同菌龄对高温的敏感性不同。多数微生物的营养体和病毒在50~65℃，10分钟就会被杀死；但各种孢子、特别是芽孢最能抗热，其中抗热性最强的是嗜热脂肪芽孢杆菌，要在121℃，12分钟才被杀死。对同种微生物来讲，幼龄菌比老龄菌对热更敏感。

b.微生物的数量多少显然会影响灭菌的效果，数量越多，热死时间越长。

c.培养基的成分与组成也会影响灭菌效果。一般地讲，蛋白质、糖或脂肪存在，则提高抗热性，pH在7附近，抗热性最强，偏向两极，则抗热能力下降，而不同的盐类可能对灭菌产生不同的影响；固体培养基要比液体培养基灭菌时间长。

04

灭菌对培养基成分的影响：

a.pH值普遍下降。

b.产生混浊或沉淀，这主要是由于一些离子发生化学反应而产生混浊或沉淀。例如Ca+2与PO4-3化合，就会产生磷酸钙沉淀。

c.不少培养基颜色加深。

d.体积和浓度有所变化。

e.营养成分有时受到破坏。

2、辐射

利用辐射进行灭菌消毒，可以避免高温灭菌或化学药剂消毒的缺点，所以应用越来越广，目前主要应用在以下几个方面：

1）接种室、手术室、食品、药物包装室常应用紫外线杀菌。

2）应用β射线作食品表面杀菌，γ射线用于食品内部杀菌。经辐射后的食品，因大量微生物被杀灭，再用冷冻保藏，可使保存期延长。

3、过滤

采用机械方法，设计一种滤孔比细菌还小的筛子，做成各种过滤器。通过过滤，只让液体培养基从筛子中流下，而把各种微生物菌体留在筛子上面，从而达到除菌的目的。这种灭菌方法适用于一些对热不稳定的体积小的液体培养基的灭菌以及气体的灭菌。它的最大优点是不破坏培养基中各种物质的化学成分。但是比细菌还小的病毒仍然能留在液体培养基内，有时会给实验带来一定的麻烦。

二 化学方法

一般化学药剂无法杀死所有的微生物，而只能杀死其中的病原微生物，所以是起消毒剂的作用，而不是灭菌剂。

能迅速杀灭病原微生物的药物，称为消毒剂。能抑制或阻止微生物生长繁殖的药物，称为防腐剂。但是一种化学药物是杀菌还是抑菌，常不易严格区分。消毒剂在低浓度时也能杀菌（如1：1000硫柳汞）。由于消毒防腐剂没有选择性，因此对一切活细胞都有毒性，不仅能杀死或抑制病原微生物，而且对人体组织细胞也有损伤作用，所以只能用于体表、器械、排泄物和周围环境的消毒。

常用的化学消毒剂有：石碳酸、来苏水（甲醛溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。答案来自

主要包括以下三种：干热灭菌；湿热灭菌；紫外灭菌
1.干热灭菌法
1.1灼烧与火焰灭菌：灼烧主要用于接种工具灭菌,在火焰上灼烧即可达灭菌目的,火焰灭菌通常用于无菌操作中试管口、玻璃瓶口、硅氟塑料塞等实验物品的灭菌,防止管口污染。
1.2干烤灭菌：利用热辐射及干热空气进行灭菌.将待检灭菌的物品如金属、玻璃、陶瓷制品包装后,在烤箱内加热至160℃,保温2h可完全灭菌.但不宜超过170℃.此外降温过速,骤冷易引起玻璃器皿炸裂.干热灭菌时装入干烤箱内的物品切勿紧密,应有空隙,利于热空气流动,过密,致使温度不均,部分物品灭菌不彻底.
2.湿热灭菌法
通过加压提高蒸汽温度,用高压蒸汽灭菌,温度高,灭菌效果最好.
注意事项：1.完全排除高压灭菌器内的冷空气.有冷空气存在时,在同一表压下所达到的温度值要低,而冷空气排出越少,温度就低得越多.在高压蒸汽灭菌时,为保证达到规定的温度,必须将冷空气完全排除.否则,虽然压力达到,而温度达不到规定的要求,灭菌就不彻底.
3.紫外线
杀菌谱广,但穿透力弱,影响因素多,杀菌效能受到一定限制.
紫外线消毒效果与紫外线强度、照射时间、温度与湿度等因素有关.紫外灯杀菌的温度以20~40℃,相对湿度40%~60%为宜.