我要检测的蛋白是100KD，配置了8%的分离胶，该用多大的电压来跑分离胶？

Western Blotting Protocol

1. 细胞裂解
只用于western的细胞可以直接用1%SDS/PBS裂解，要用于IP，co-ip之类的实验的蛋白用裂解液I&II的方法（这个我还没有涉及到）。
1） 收细胞：贴壁细胞直接洗掉培养基，再用PBS清洗两遍后直接置于液氮中，-80°C保存。悬浮细胞低速离心2min，用PBS清洗后，直接置于液氮中，-80°C保存。
2） 加入适量的1%SDS，混匀，100°C，5-10min。13400rpm，4°C，20min。
3） 取上清于新管中。
4） 测量浓度：采用分光光度法
BCA protein Assay Reagent A：500μl
Sample: 5μl
BCA protein Assay Reagent A：10μl
PS:根据蛋白的浓度曲线得到相应的浓度。

2. 跑胶
配胶的protocol和咱们实验室差别不大，各人可能根据习惯对一些数据稍作调整都关系不大。
上样量：3μg-15μg，根据蛋白峰值的不同进行调整。
200V电压跑45min左右

3． 转膜（半干转）
1） 将胶小心从板上拿下来，置于transfer buffer 中（1×transfer buffer中加入20%甲醇）洗掉running buffer，15min。
2）将NC膜置于100%甲醇中激活一分钟。
3）将胶转到NC膜上，注意防止气泡（可用温度计之类的赶掉气泡），17V恒压20min。
4）将膜转入乘有TBST的容器中（注意始终保持膜的湿润）。
5）5%的牛奶在室温blocking 1h。

4． 杂一抗
用TBST洗掉牛奶（如果一抗是溶于牛奶中则不用洗的很干净）。
PS: 根据抗体特性的不同，有些抗体要溶于冷牛奶（4°C）中，有些抗体要溶于TBST中。
加入一抗，一张膜1ml就够，封于塑料封口膜中，注意赶走气泡，4°C过夜。

5． 杂二抗
用TBST洗净一抗（一抗可重复使用），加入二抗室温1h。

6． 显色
这里用的是老式的拍照手法。

洗净二抗，准备显色液：显色液以TBST: 显色液I:显色液II(咱们实验室有的那种，名字我没记下来)=2:1:1的比例配好（可根据蛋白信号的强弱调整）。
将膜侵入显色液中incubate 5min。
在暗房里拍照。

来自匹兹堡大学吴传越实验室

80-180v