怎么判断差异表达的基因

2025-02-05 20:54:02

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回答1：

真核生物中，从个体的生长、发育、衰老、死亡，到组织的得化、调亡以及细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及基因的选择性表达。高等生物大约有30000个不同的基因，但在生物体内任意8细胞中只有10%的基因的以表达，而这些基因的表达按特定的时间和空间顺序有序地进行着，这种表达的方式即为基因的差异表达。其包括新出现的基因的表达与表达量有差异的基因的表达。生物体表现出的各种特性，主要是由于基因的差异表达引起的。
由于基因的差异表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制，通过比较同一类细胞在不同生理条件下或在不同生长发育阶段的基因表达差异，可为分析生命活动过程提供重要信息。研究基因差异表达的主要技术有差别杂交（differential hybridization）、扣除（消减）杂交（subtractive hybridization of cDNA，SHD）、mRNA差异显示（mRNA differential display， DD）、抑制消减杂交法（suppression subtractive hybridization，SSH）、代表性差异分析（represential display analysis，RDA）、交互扣除RNA差别显示技术（reciprocal subtraction differential RNA display）、基因表达系列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）、电子消减（electronic subtraction）和DNA微列阵分析（DNA microarray）等。
一、差别杂交与扣除杂交
差别杂交（differential hybridization）又叫差别筛选（differential screening），适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA的cDNA克隆。为了增加这种方法的有效性，后来又发展出了扣除杂交（subtractive hybridization）或扣除cDNA克隆（subtractive cDNA cloning），它是通过构建扣除文库（subtractive library）得以实现的。
（一）差别杂交
从本质上讲，差别杂交也是属于核酸杂交的范畴。它特别适用于分离在特定组织中表达的基因、在细胞周期特定阶段表达的基因、受生长因子调节的基因、以及在特定发育阶段表达的或是参与发育调节的基因，同时亦可有效地用来分离经特殊处理而被诱发表达的基因。目前，差别杂交筛选法在克隆基因的分离工作中有着相当广泛的用途。
差别杂交的技术基础十分简单，它不需要任何有关的目的基因的核苷酸序列信息，而重要的是耍拥有两种不同的细胞群体：在一个细胞群体中目的基因正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达。在这种情况下便可制备到两种不同的mRNA提取物。其一是含有一定比例的目的基因mRNA类型的总mRNA群体，其二是不含有目的基因mRNA类型的总mRNA群体。因此，可以通过这两种总mRNA（或是它们的cDNA拷贝）为探针的平行杂交，对由表达目的基因的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选。当使用存在目的基因的mRNA探针时，所有包含着重组体的菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点，而使用不存在目的基因的mRNA探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片并对照原平板，便可以挑选出含目的基因的菌落，供作进一步研究使用。
差别杂交筛选技术已被成功地用于分析爪蟾和粘菌的发育问题。这两个应用例子表明，处于不同发育状态或阶段的丰度相差5倍的特异的mRNA种是能够被检测出来的。生长因子调节基因（growth factor-regulated gene）的克隆，是差别杂交成功应用的一个典型例子。我们知道，血清中含有生长因子，因此用血清处理处于静止期的细胞时，便会迅速诱发生长因子调节基因进行表达。所以，分别从静止期细胞培养物和经血清激活3小时的细胞培养物中提取的poly(A)mRNA制剂，在mRNA种类上是有差别的，至少后者比前者多出了一种生长因子调节基因的mRNA类型。用从激活细胞中分离的poly(A)mRNA反转录合成的cDNA与λ噬菌体载体重组，构成cDNA文库，并同时复制两份硝酸纤维素滤膜。A组滤膜同血清激活细胞制备的cDNA探针杂交，B组滤膜同静止期细胞制备的cDNA探针杂交。将所得的放射自显影图片进行仔细的比较，从中鉴定出只同激活细胞探针杂交而不能同静止期细胞探针杂交的噬菌斑位置。这些克隆便有可能是带有受血清诱发表达的生长因子调节基因的DNA编码序列。
（二）扣除杂交
差别杂交可有效地对于因特殊处理而被诱发产生的mRNA的cDNA克隆的分离，或是在细胞中具高表达效率的mRNA之cDNA克隆的分离，但对于低丰度的mRNA的cDNA克隆的分离则有相当的困难。为了进一步提高差别杂交的筛选效率，一种切实可行的办法是应用扣除杂交筛选法构建富含目的基因序列的cDNA文库。
扣除杂交法的本质是除去那些普遍共同存在的、或是非诱发产生的cDNA序列，从而使待分离的目的基因的序列得到有效的富集，提高了分离的敏感性。下面以T细胞受体（T-cell receptor，TCR有时亦称之为T细胞抗原受体）编码基因的分离为例子，说明扣除杂交筛选法的基本原理与简要过程。T细胞和B细胞来自共同的前体细胞，两者都能够识别特异的抗原。但与B细胞不同，T细胞不能识别游离的抗原，而只能识别在其它细胞表面的抗原。T细胞的这种抗原识别特异性是由TCR基因决定的。TCR基因只能在T细胞中表达，而不能在B细胞中表达。那么从T细胞mRNA制备来的单链cDNA，同大大超量的B细胞的mRNA在有利于发生DNA-RNA杂交的条件下保温，其结果会是所有的能够在T和B两类细胞中同时表达的T细胞基因的cDNA分子（约占98％），都能与B细胞的mRNA退火形成DNA-RNA杂交分子，而不能在B细胞中表达的、T细胞特有的cDNA（约占2％），由于B细胞中没有相应的mRNA，故不能形成DNA-RNA杂交分子，仍然处于单链的状态。将此种杂交混合物通过羟基磷灰石柱（hydroxylapatite column），于是DNA-RNA杂交分子便结合在柱上，而游离的单链cDNA则过柱流出。回收到的T细胞特异的cDNA被转变为双链cDNA之后，与适当的λ噬菌体载体重组并转染给大肠杆菌寄主细胞，这样便得到了T细胞特异cDNA高度富集的扣除文库。然后再按照同样方法制备扣除的cDNA探针，即被B细胞mRNA杂交扣除了的T细胞特异的cDNA探针，筛选文库，可成功地分离到了T细的TCR基因。
扣除杂交法同样也可以用来分离缺失突变基因。从野生型植株制备的染色体总DNA，用一种适当的核酸内切限制酶（比如Sau3A）切割成小片段。同时从缺失突变体植株制备的染色体总DNA，经随机切割之后，用生物素（biotin）进行标记，作为非同位素标记探针使用。取大大超量的此种探针，同Sau3A酶切的野生型染色体总DNA片段混合，经变性、退火处理，溶液中的无生物素标记的野生型的DNA分子便同生物素标记的突变型的DNA探针杂交。将杂交反应混合物通过生物素结合蛋白质柱（avidin column）。这种柱是用包裹着生物素结合蛋白质的专用的细小磁珠装填的。大部分野生型植株的DNA分子都同突变型植株的生物素标记的DNA探针杂交，便被结合到柱上。而野生型植株的DNA片段由于在突变型DNA中缺失了相应的片段，故没有相应的生物素标记的探针与之杂交，经洗脱便过柱流出。随后将洗脱收集的DNA同超量的生物素标记探针再杂交，再过柱。如此经过多次重复富集之后，用PCR法扩增DNA片段，并予以克隆。最后用Southern杂交法进一步鉴定出，只同野生型DNA杂交而不能同突变型DNA杂交的含有突变基因的阳性克隆。

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