elisa加入底物后应该注意什么 问题

     以OPD和TMB为底物的显色 

•     在目前的以HRP作为标记酶的商品ELISA试剂盒中，如以TMB为底物，则提供的底物为A和B两瓶应用液；如以OPD为底物，则试剂盒提供OPD片剂或粉剂，临用前配制。37℃ 30分钟可使HRP的底物催化反应完全，为使弱阳性样本孔能有充分的显色，建议在37℃下反应25～30分钟后，终止反应比色测定。 

•     此外，在加入底物开始显色反应前，最好是先检查一下底物溶液的有效性，即可将A和B两种液各加一滴于清洁的空板孔或eppe ndorf管中，观察是否有显色出现，以OPD为底物，配好后应为无色，则需避光进行，否则就不能使用。以TMB为底物，整个显色反应无需避光，显色反应完成后，加入酸终止反应，振荡混匀后即可进行下面的比色测定或肉眼判断结果。

  ELISA的比色测定 

•     ELISA的比色测定由酶标仪进行测定后，有许多阴性测定孔的吸光度值为负数或测定假阳性率大大增加等。这主要是未能正确理解和使用酶标仪所致。故需强调下面两点：1）比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否已调至合适或所用滤光片是否正确。在行ELISA测定时 ，以TMB（比色波长450nm）为底物和以OPD（比色波长492nm）为底物的试剂盒均有使用，滤光片需根据要求随时更换。故易出现滤光片错用的问题。2）单波长或双波长比色选择的问题。单波长比色以对显色具有最大吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定；而双波长比色则在敏感波长450nm和非敏感波长630nm各测定1次。敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和。非敏感波长下测定即改变波长至一定值，使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的为脏物的吸光度值。最后酶标仪给出的数值为敏感波长与非敏感波长下的吸光度值的差。如在使用双波长比色时，仍设空白孔，就可能会造成前面提到的测定孔吸光度为负数的现象。由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，故而在ELISA测定比色时最好使用双波长比色。 

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