如果你确认 “转化后挑取含有目的片段的单菌落”这个步骤正确的话，就是你的PCR出问题了么，继续扩增便可。
目的片段与载体脱离还是保留的菌种失活? 应该都不会。我认为你的PCR体系除了问题，换一组酶和buffer，提一下模板，重做吧，会出来的。
很明显，你挑了假阳性。
你既然已经从更高的标准上验证了含有目的片段,而且是正确的,为什么还要纠结低标准的检验结果呢??菌落PCR不出结果很正常,杂质太多了,如果你确定你用来画线的菌里面有目的片段的话,就是PCR有问题
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